|
转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 小伙伴们，还在惆怅自己的课题计划被导师认定无创新力而被毙掉吗？还在焦虑自己的实验计划只是做做自噬、凋亡、增殖吗？还在担忧自己的super marker基因和别人一样吗？ 为此小编发动思维为大家献上了一个DNA修复机制的文章《ELL2 regulates DNA non-homologous end joining (NHEJ) repair in prostate cancer cells》，希望能为您的课题计划在简单的细胞表型基础上锻造出一个深入的起点，让你简单的基因从泯然众人矣瞬间脱颖而出。 这项研究主要是检测在LNCaP、C4-2和 PC3三种前列腺癌细胞系中，在放疗抵抗的情况下，ELL2基因是如何参与调控DNA修复。 通过在3种细胞中敲除ELL2后，然后利用阿霉素（Dx）和ɣ照射诱导DNA双链损伤模型，而后进行验证ELL2基因如何参与放疗抵抗机制。 （1） ɣH2AX是DNA双链断链损伤的标记，当在细胞中加入阿霉素或者ɣ照射后，ɣH2AX的表达水平升高。 在C42细胞中加入0.25ug时，与对照组相比，ɣH2AX的表达水平增高；而提高到0.5ug时，与对照组相比，ɣH2AX的表达水平却没有显著性差异。 在LNCaP细胞系先前的研究显示随着剂量增加到0.5ug/ml的时候，与对照组相比，ɣH2AX的表达水平也增高，然后当过表达EAF1后，ɣH2AX的表达水平就降低了。 采用在细胞中处理Dx24h和在ɣ-irradiation 8h。 在P53负调节的细胞株PC3且敲除ELL2的情况下中，ɣH2AX的表达水平依赖于Dx或者ɣ-irradiation的处理，表明P53并不是ELL2调节DNA修复的必要蛋白。 （2）采用单细胞凝胶电泳法，在C42细胞中敲除ELL2后，观察彗星尾。结果显示，干扰组与对照组相比，并且在Dx和IR的处理下，出现较长的彗星尾，表明DNA断裂损伤较多。 （3）当在C4-2细胞中过表达ELL2后，并在阿霉素或者离子辐射后，观察ɣH2ax的表达水平，结果显示与对照组相比，干扰组中的ɣH2ax的表达水平显著下降。 以上的这些结果表明，ELL2能够保护细胞免受DNA损害，增强了DNA修复作用。 （1）在没有Dx作用下，在C4-2细胞中，干扰ELL2后，细胞克隆形成能力较高。 （2）在Dx（0.1ug/ml）作用下，干扰ELL2后，显著减少了C4-2的克隆形成能力。 以上这些结果表明，ELL2可能参与了DNA的损伤修复机制。 DNA的修复方式有两种，NHEJ和HR。课题组选用H1299dA3-1#1 和Hela pDR-GFP两种建立好的细胞系探索ELL2参与DNA修复的机制。H1299dA3-1#1细胞系是具有完整的DNA片段，和I-SceI内切酶的两个识别位点。 NHEJ修复DNA断链末端时，由上游的CMV启动子驱动了EGFP基因中EGFP的表达，这就为DNA修复提供了准确的测量方法。与干扰的载体对照相比，干扰ELL2后减少了EGFP阳性细胞的比率，显示ELL2参与了NHEJ修复机制。 Hela pDR-GFP是用来检测HR修复方式，该基因含有一个I-SceI位点，与干扰载体对照组相比，GFP标记的阳性细胞没有差异。表明ELL2没有参与HR的修复机制。 核心的NHEJ蛋白包括DNA-PK和连接酶ligase IV/XRCC4/XLF复合物。 （1）首先通过405 nm的激光微照射（laser microirradiation）技术发现GFP标记的ELL2蛋白聚集在DNA损伤位点。 （2）共转染GFP标记的ELL2和RFP-Ku70 或 RFP-Ku80在C42细胞内之后，利用laser microirradiation技术发现 GFP ELL2与RFP-Ku70 或 RFP-Ku80聚集在DNA损伤位点处。 （3）共同定位在DNA断裂损伤处表明他们很有可能在物理上相互结合。HEK293细胞转染过表达ELL2并且用GFP标记，转染GFP-Ku70, 或者GFP-K80。在Dx处理和未处理时，GFP-KU70和ku80被ELL2抗体所沉淀。这表明ELL2能够与KU70或者ku80蛋白相结合。 在NHEJ修复DSBs的过程中，第一步便是KU70/80二聚体结合到DNA残链末端。 （1） 采用laser microirradiation技术观察，敲除掉ELL2基因后，抑制了KU70/80聚集到DSB末端位点。 （2） 重新转染ELL2进入siELL2 C4-2细胞系后，便恢复了ELL2的表达，结果显示KU70/80聚集在DSB断裂位点。 这些结果表明，ELL2蛋白通过参与到KU蛋白复合体中并且识别DSB位点，从而发挥调控DNA损伤的过程。 小伙伴们，以上就是文章的全部内容，有没有被DNA损伤修复的机制启发到呢！
|
|
|
