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近日，中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫重点实验室施一研究组与河南农业大学、国家兽用药品工程技术研究中心田克恭教授合作，在靶向伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）囊膜糖蛋白gB的中和抗体研究方面取得重要进展，为伪狂犬病毒疫苗和抗体研发提供了重要理论基础。 伪狂犬病病毒（PRV）是感染许多家畜的新兴的兽医病原体。自2011年以来，中国许多农场出现高致病性PRV变异，给动物产业带来了巨大的经济负担。但目前市售疫苗无法对这些新出现的菌株提供有效保护。包膜糖蛋白B（gB）是已知在PRV进入中起关键作用的主要病毒抗原。为了控制PRV流行和治疗相关疾病，将结构和免疫学方法结合起来，产生针对PRV gB的潜在中和抗体，并研究其工作机制。鉴定了总共15种单克隆抗体（mAb），具有良好的中和活性。其中，14株单克隆抗体靶向PRV gB的IV区，通过补体效应阻断病毒进入。相反，剩余的1H1mAb识别PRV gB的结构域I，其可以中和不依赖于补体的病毒进入，并可能通过干扰膜融合过程。工作揭示了PRV gB的结构细节和免疫原性，并且可能为开发针对PRV感染的抗病毒治疗剂和疫苗提供重要的指导。 PRV属于疱疹病毒科水痘病毒属，是一种能感染多种家养及野生动物的病原体。从2011年开始，我国的多个猪养殖场相继出现高致病性的PRV变异株感染疫情，造成了巨大的经济损失。然而现有的疫苗只对传统PRV毒株有效，却不能对新流行的突变株提供有效的保护，因而开发新型的PRV疫苗和治疗性药物对于疫情控制至关重要。gB是PRV表面一种重要的囊膜糖蛋白，在病毒入侵细胞过程中起着关键作用。同时，gB也是一种重要的病毒表面抗原，能够诱导机体产生中和抗体以对抗病毒感染，因此，gB成为伪狂犬病毒疫苗和药物设计的一个理想靶标。 用Bac-to-Bac表达系统表达了PRV gB的胞外结构域。然后将纯化的可溶性gB蛋白质用于免疫小鼠。最初由间接ELISA从数百个杂交瘤细胞中选择总共43个gB特异性mAb。然后进行病毒进入抑制测定以评估这些mAb的中和活性。通过添加或不添加外源兔补体来平行地进行测试以鉴定潜在的补体依赖性中和活性。鉴定了总共15种中和性mAb，其有效地阻断了PRV进入猪肾细胞（PK-15）。其中，14种单克隆抗体仅在补体存在下阻断病毒入侵，表明它们通过补体效应发挥中和活性。剩下的一个1H1mAb直接中和了病毒而不添加补体。因此，1H1 mAb可能通过干扰受体结合或膜融合过程来阻断PRV的进入。 研究人员通过免疫学方法，筛选获得了15株针对gB的鼠源中和抗体， 作为唯一不依赖补体的中和抗体，进一步分析了1H1单克隆抗体对八种不同PRV毒株，包括疫苗毒株（Bartha和HB98），经典毒株（RA和SU）以及目前新出现的变种毒株（HN1201 ，188-5,072-1和BH1）。有趣的是，1H1单克隆抗体显示出广谱的中和活性，对所有测试的PRV毒株都有不同的功效。它能有效地中和HN1201，BH1,188-5，RA和Bartha菌株，IC50值为15.2〜31.6μg/ mL。相比之下，阻断SU，072-1和HB98菌株的进入效果不佳，其中IC50值从68.31至92.73μg/ mL变化。由于1H1 mAb靶向PRV gB，不同PRV毒株的gBs共享超过95％的序列同一性，所以可以想象1H1 mAb中和了一大批PRV毒株。 并对其作用机制进行了深入研究。根据抗体发挥中和作用的补体依赖性进行区分，这15株抗体被划分为两个类群——其中有14株依赖于补体而发挥中和活性，另外1株（1H1）则不依赖补体而直接阻断病毒入侵。并且，1H1单克隆抗体具有广谱中和活性，能抑制传统野生型和多种变异株PRV感染细胞。为了探索这些抗体的中和机制，研究人员通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、生物膜干涉技术（BLI）和电镜三维重构技术，揭示了上述两类抗体的表位在gB表面的分布。其中14株补体依赖性抗体的表位均分布于gB的头部区第四结构域，而1H1的表位则位于含有融合肽（fusion loop）的gB基部区第一结构域（图1）。并且，1H1的表位被初步定位于以gB 基部区210螺旋为中心的区域，其中第214位的精氨酸在gB和1H1相互作用中起着至关重要的作用（210-helix，图2）。由于该表位与融合肽较为邻近，提示1H1抗体的结合很可能会干扰病毒与细胞之间的膜融合过程从而发挥中和作用。综上所述，该项研究证明了gB的头部区和基部区含有多种抗原表位，而靶向不同表位的抗体通过不同的作用机制抑制病毒感染细胞，为抗病毒药物的开发以及亚单位疫苗的研发提供了新的思路。 该项研究得到了国家重点研发计划、科技部973项目、国家自然科学基金委优秀青年基金、中国科学院青年创新促进会以及河南省重大科技项目等的资助。该研究同时得到了中国科学院微生物研究所高福院士、四川大学逯光文教授等专家的支持。相关成果于2017年12月20日在国际知名微生物学期刊PLoS Pathogens上在线发表。该文章第一作者为国家兽用药品工程技术研究中心李向东博士，河南农业大学教授、国家兽用药品工程技术研究中心主任田克恭及中国科学院微生物研究所研究员施一为论文共同通讯作者。 |
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