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一、单抗亚型鉴定(亚型,单抗,腹水,阳性克隆) 筛选出阳性克隆后，制备了腹水，可是鉴定亚型的时候，发现亚型不纯，有好几种，不知道是什么  原因。亚型鉴定选用的是SBA的亚型分选试剂盒。腹水没有纯化，离心后直接测得。请大家帮我分析一下是什么原因？答：你要测亚型必须用细胞培养上清或者是纯化后的抗体，绝对不能用腹水：腹水的成分很杂，包含小鼠本身的IgG。另外还有可能是你的细胞株本身就不是单克隆，SBA的亚型试剂盒我没有用过，我用过sigma的是ELisa方法测定亚型，很不好用。用serotec试纸条或bethly免疫扩散效果很好；HBT的试纸条也不错，操作简单，2-3小时搞定，推荐用细胞上清来检测，不易出现多亚型误检。缺点是价格偏高；谢谢了。从大家的分析来看亚型不纯由以下原因产生：1.腹水需要纯化后再测亚型。2.单克隆筛选不纯。 二、单抗亚型鉴定为何全部是IgM 在小鼠免疫阶段，是按照经典方法进行免疫的：经过基础免疫，三次加强免疫（间隔三周），小鼠效价达到1：12800以上，末次冲击免疫三天后，取脾细胞与SP2/0细胞融合，然后根据间接ELISA检测效价上清结果和有限稀释法进行筛选和亚克隆，其中的酶标二抗用的是辣根酶标记的羊抗鼠IgG（Fc片段），三轮亚克隆后得到五铢全阳株，可是经过取他们的细胞上清进行亚型鉴定结果全是IgM。 并且最近师兄们做的其他抗原筛选到的单抗，经过腹水鉴定也全是IgM。。。不知道原因何在。。 请院子里的战友指点迷津： 1.在制备单抗过程中，如何能最大限度的制得IgG型单抗，影响其为IgM的因素都有哪些？？如果说免疫方法和筛选阶段所用的酶标二抗有最大影响的话：我上面的免疫程序和用的酶标二抗都是朝着IgG而设计的。。 2.在进行亚型鉴定过程中，在对单抗株细胞上清进行浓缩的时候，会不会也将细胞上清中的小牛血清也进行了同等的浓缩，10% 的小牛血清和1～5mg/L的单抗浓度相比，在鉴定亚型过程中有没有可能只是鉴定出来了小牛血清中的各种抗体亚型？？ 3.能否请有志之士给出亚型鉴定两种方法（ELISA和免疫双扩）的详细步骤（经过实践证明了得，可行的）？？例如：在免疫双扩的时候上清中抗体浓度应该在什么范围之内？？而腹水浓度又应该设在什么范围之内？？ 4.请大家给推荐几个性价比高的鉴定亚型的试剂盒。。。 有点乱。。。是因为我已慌了 答：这次鉴定的试剂盒有问题，建议换一个试剂盒。  三、抗体的亚型选择、恒定区序列改造-分子设计考虑 在抗体药物中IgG有4个亚型，本身具有的结构特点如Hinge序列及原本功能特点使其治疗应用上有较大区别。另外目前基因工程使得改造变为现实。 IgG3由于其半衰期比较短并且hinge区域易水解，限制其在药物中应用，但是也有文献提到做融合蛋白时增大柔性时会考虑使用。 需要ADCC和CDC效应的，优先选择IgG1，并且有细胞株敲除岩藻糖，使得ADCC效应增强，例如CD20抗体； 如果只是阻断抗体，不需要ADCC和CDC效应，优先选择IgG4，例如目前国外获批上市的PD-1抗体（Keytruda、Opdivo），均为IgG4，并且进行了S228P改造。IgG4存在的问题是容易形成半抗体（发生Fab-arm的交换），S228P的突变就是降低Fab-arm的交换。 目前也有部分抗体采用IgG2的，主要也是低ADCC和CDC效用。 IgG1亚型的选择这个话题很有意义，IgG1其实是现在最成熟的，研究最多的。IgG4亚型在近几年应用也慢慢增多，IgG4在通过S228P突变解决Fab-arm exchange后还有一个问题，就其稳定性不好，但是现在有很多成药的都在用IgG4，例如PD-1等等，不知道这一块如何解决？在制剂上下功夫？ 关于IgG2这个成药的几乎寥寥无几，主要因为IgG2的二硫键错配问题，IgG2的二硫键远比IgG1和IgG4的复杂，如果想用IgG2亚型就得考虑二硫键的问题。 根据我们的经验，IgG4 Fc对于pH非常敏感，低pH时候非常容易发生沉淀（聚集），然而高pH容易发生脱酰胺。 糖基化对于抗体稳定性确实有比较大的影响，我们IgG4 Fc是在E.Coli表达的，从长期稳定性数据来看，好像影响不大（可能case by case），或许象你说的，去糖基化会对pH变得更加敏感。 制剂方面，我们重点考察了pH范围以及缓冲体系，避免聚集的发生 IgG4 Fc的Deamidation导致酸性峰增加，其主要原因可能是由于pH导致的。我们采用LC-MS/MS方法，鉴定结果显示酸性峰deamidation位点主要是NG和NS（G和S都是属于空间位阻较小的氨基酸）: - EEQFNSTYR - VVSVLTVLHQDWLNGK - GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK 上面是我们项目的数据，主要位于CH2区域，仅供大家参考。对于ADCC、FcRn、PK和免疫原性没有深入研究过，但是由于脱酰胺在人体中可天然发生，免疫原性应该不会有问题。 |
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