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你是否曾遇到这样的问题，老板让你研究一个新的基因，你需要用到这个基因的质粒，可是实验室没有师兄师姐研究过，所以光靠换载体这点技能已经不足以让你构建出你所需要的质粒了，然而公司的报价特别高，一千两千还是便宜的，甚至还有报价上万的质粒，并且货期很长，老板催促你要结果，或者不愿意花那么多钱给你买质粒，这时候你该怎么办？今天教的这一招，你以后都可以自己动手从零开始构建质粒啦。 构建质粒，最重要的是两样东西，一个是这个基因的CDS片段，另一个是空载，对于常做分子克隆的实验室，空载是肯定有的啦，没有的话去隔壁实验室借一点也是没问题的，所以问题的重心就是CDS片段怎么来！！ RNA大家都提取过吧，做QPCR之前要先从处理过的细胞中提取RNA，然后逆转录成CDNA。想到了吧，我们的CDS片段就可以从这一堆CDNA里挑出来，我们用来构建质粒的CDNA与用来做QPCR的CDNA唯一的不同在于，我们逆转录用的酶不一样，在这里给大家推荐一款： 全式金的AT321 TransScriptTM II All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for PCR 用你手上有的细胞提取RNA，接着用此酶进行逆转录获得CDNA，之后就可以用这个CDNA作为模板来进行后面的实验了。有时候可能在某个细胞株中你所需要的基因恰好是有突变的，这时候你可以换个细胞株试试，也可以尝试把突变的地方再突变回来。 接着我们以KLF4基因为例来构建质粒： 1、首先在PUBMED中找到KLF4的CDS序列，在GENE中搜索KLF4，选择HOMO，点击进入  2、进入下面这个页面之后，一直往下拉，  3、拉到这个位置，选择自己需要的转录本，在这里我选择第一个，点击进入  4、页面如下，往下拉，看见CDS，点击CDS可以使此基因的CDS序列显示为高亮文本，如图    5、为了可以完整的把CDS序列P出来，所以我们的引物应该设计在高亮文本以外的区域，打开Primer-BLAST来设计引物  6、将刚才查到的所有的序列复制粘贴入输入框中，输入引物的范围，产物的大小，最小为CDS的长度，最大为贴入这段序列的长度  7、点击GET Primers  8、挑选一对副产物少的引物就好了  9、引物合成后，就可以以CDNA为模板P出你想要的片段了。PCR结束之后跑DNA胶，看产物大小是否正确，若正确，进行切胶回收，便可进行下一轮的PCR。 10、第二次PCR使用的引物设计方法就跟换载体那种构建质粒的方法一样啦（同源重组法或者T4连接法都可以），不同的地方是，换载体的时候，我们使用的模板是已有我们基因序列的质粒，在这里我们使用的是第九步中的PCR产物。 11、在第十步中得到的PCR产物切胶回收后，再与酶切好的载体连接，之后做转化，长出克隆后进行测序，测序成功之后就大功告成了。 策到这，相信大家已经掌握这项新技能了吧！赶紧试一试，然后发家致富吧！ |
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