如何评价总RNA或mRNA的质量

ypgao 2018-03-22

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之前只是做数据分析，被问到实验方面的东西就傻眼了，什么都不会。特此总结了网上的一些信息。该篇日志综合了多个网上的资源，未提供引用信息还望见谅!

1. 相关概念

RNA质检参数OD260/OD280、OD260/OD230的意义。

260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。

A230: 测定其它碳源物质，如酚，糖类等。

A260：核酸的吸收峰测，测RNA，DNA，引物等的浓度用的。

A280：蛋白质的吸收峰。

一般的，我们只看OD260/OD280(Ratio，R)在1.8~2.1范围内时，我们认为 RNA中蛋白的污染是可以容忍的，不过要注意，当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应该是<2.2的）。当R < 1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显，可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当R > 2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。

2. RNA质量检验

RNA样品的品质检测一般分为总量，纯度与完整性三大项。

总量：微量分光光度计测260nm吸收值计算。

纯度：微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值，用于评估有机溶剂残留；260nm/280nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。

完整性：以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis)，并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差。

l RNA纯度

RNA在纯化过程中容易受到DNA、蛋白质及有机溶剂的影响，这些残存物将会影响以后的操作。光谱分析(NANODROP)利用物质对不同波长光的吸收度的不同，可以鉴别出溶液纯度及浓度。RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围一般为1.8-2.1。各项实验对RNA纯度要求不一，比如即使比值超出这个范围，RNA样品也一样可以用于一些普通实验中，如Northern杂交、RT-PCR、荧光定量PCR和RNA酶保护等实验。

RNA Purity test:

1. protein contamination

OD260/OD280 ratio: 1.8-2.1 recommended

2. Organic solvent contamination:

OD260/OD230 ratio: > 1.8 recommended

OD260/OD270 ratio: > 1.2 recommended

l RNA完整性

除纯度以外，RNA的完整性也非常重要。自然界无所不在的RNase使RNA保存相当不易。由于RNase广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解。

1）电泳法

2）流式芯片(2100 Bioanalyzer)

电泳显示有无基因组DNA污染，有无RNA降解(28S, 18S条带)；通过目测28S和18S条带的比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为28S:18S >= 2可以初步判定总RNA完整性较好。跑电泳，RNA应出现清楚的两条Band (28S/18S rRNA)，有时会有第三条band (5S rRNA)，最上方不可出现DNA污染条带，28S/18S应近似两倍。28S和18S核糖体RNA条带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），在加样孔位于图片上方的看图模式下，上面一条带（28S）的密度大约是下面一条带（18S）的2倍。下方还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA等）组成。在28S和18S 核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，此时最好需要对总RNA进行纯化。RNA的降解则表现为核糖体RNA带的弥散。上述方法可以清楚分析RNA的完整性，但需样本量过多。流式技术需求量降到25ng，除28S，18S外不应该有其他峰值，28S/18S应该在1.8-2.1之间。

Integrity test by electrophoresis

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