PLANT PHYSIOL：iTRAQ植物高分文章解读

微笑如酒 2018-03-26

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发表时间： 2018

发表期刊：《Plant Physiology》

影响因子： 6.392

研究背景

ACTIN相关蛋白（ARP6）突变植物的根部表型变化与Pi低浓度下表型类似，主根较短，根须密而长，从而影响植物对磷酸盐的摄取。Ovarian tumor domain（OTU）属于去泛素化酶基因（DUBs）家族，在拟南芥中很少被研究，该家族涉及通路和基因与ARP6相似。

研究目的

为了揭示OTU5基因在植物根形态生长和Pi吸收中的功能和机制，作者通过蛋白组学和相关功能实验研究OTU5基因突变以及在Pi应激下引起根形态变化的分子机理。

研究思路

研究结果

在Pi不同浓度条件下根的表型研究

与野生型相比，otu 5和arp 6突变型单位长度根须数量显著增加（36%），主根长度变短，根须显著变长；otu 5和arp 6没有明显的区别；otu 5/arp 6双突变也呈现otu 5的表型，且变化更加明显，有性状叠加的现象。其它几种otu 5/OTU5和OTU 5 OE没有变化（图1）。总之，作者发现OTU5基因不依赖于ARP6，能够抑制根的生长。此外，Pi低浓度下多种突变类型的根须明显改变，除了otu 5/arp 6双突变型植物。

图1. Pi高浓度（上）和低浓度（下）条件中根的表型

iTRAQ分析差异蛋白

首先，对Pi高浓度下Wt和otu5进行差异蛋白分析，总共发现10,328个蛋白，其中在otu 5中，分析发现了223个差异上调，267个为差异下调蛋白（图2）。

actin-like ATPase家族蛋白At2g42100显著上调4.5 fold，该蛋白与染色体重构因子ARP4, ARP5和ARP6 等相关；SNF2-RING-HELICASE-LIKE3（FRG3）, CHROMATIN REMODELLING8（CHR8）等差异蛋白也明显上调，与蛋白和细胞的生长有密切的关系。这些结果表明otu 5突变型植物改变了染色体和根须相关的蛋白的表达。

图2. Pi高浓度下Wt和otu 5型植物差异蛋白分析

其次，分别研究Wt和otu 5在Pi高浓度和低浓度下的差异蛋白，在Wt中发现382个差异上调和255个差异下调蛋白，这些差异蛋白多数与Pi 吸收和循环相关，如plasma membrane Pi transporters Pht1;1,Pht1;2和Pht1;4以及调节因子SPX1等；同时发现了一个新的分子XUT1（7.3-fold）与根变形生长相关。这些结果表明，低浓度的Pi处理诱导了Wt植物的根须相关蛋白的变化。

在otu 5中差异上调的蛋白（394个）与Wt类似，但是差异下调蛋白只有75个，这暗示了OTU 5基因可能作为低Pi浓度反应蛋白的一种抑制分子。

图3. Pi高浓度（A,B,C）和低浓度（D,E,F）下差异蛋白分析

蛋白互作网络分析

通过GeneMANIA（http://），分析结合蛋白-蛋白互作（PPI）和基因共表达网络分析，显示在otu 5植物中一些染色体重构相关的蛋白下调表达，一些histonemodifications, DNA methylation, pre-mRNA splicing, chromatin assembly和transcription等DNA进程相关基因也出现下调趋势，这些结果说明OTU 5基因的突变与染色体相关蛋白有密切的关系。

图4. Wt和otu 5染色体相关差异蛋白，基因网络分析。

黄色节点表示上调蛋白；蓝色节点表示下调蛋白；紫色节点表示Pi低浓度下差异蛋白；绿色表示与蛋白互作的基因

同时，利用Pi低浓度下和高浓度下，otu 5植物特有的差异蛋白（Wt中没有）进行网络调控分析，发现一些组蛋白间如HTB4,HTB9等，组蛋白和相关基因间如HTB4-HTA8等的互作关系（图5）。这表明不同的基因型在Pi不同条件下具有特有的调控机制。

图5. otu 5植物不同浓度下特有差异蛋白网络分析。

黄色节点表示差异蛋白；蓝色节点表示与蛋白互作的基因。

此外通过STRING（http://），发现一些根须相关蛋白peroxidases如At4g26010, At1g05240, RHS19,At3g49960以及formins如FH2, FH8,RSH15, XTH14等在Pi低浓度otu 5植物中下调，暗示它们在根须生长中发挥一定作用。

图6. otu5中差异下调的根须相关蛋白网络互作分析

功能实验

为了研究otu 5的表型变化机理，作者利用ChIP-qPCR发现根须morphogenesis相关基因（XTH26）)和chromatinremodeling (FRG4)与前人报道的组蛋白H2A.Z结合。

最后研究 reactive oxygen species（ROS）distribution变化对根须的影响，利用3’-(p-hydroxyphenyl)fluorescein HPF 检测过氧化氢，在Wt中低浓度Pi培养下，荧光减弱；otu 5中在低浓度Pi培养下荧光减弱更明显，约为Wt的三分之一（图6）这些结果表明OUT5突变参与拟南芥相关生理功能。