|
中图分类号：R781.5 文献标识码：A 文章编号：1004-4949（2013）03-00-01 口腔溃疡为口腔粘膜呈不定期或周期性在口腔粘膜任何部位出现孤立或多发的口腔粘膜溃疡。患病率居口腔黏膜病之首，本病虽不危及生命，但溃疡局部灼痛明显，妨碍饮食及言语，可不同程度地影响人们身心、工作和生活质量，占用了大量有限的医疗资源。目前人们对于该病的病因及发病机制尚不明确。本实验是通过半定量的方法，观察实验性口腔溃疡大鼠HE染色切片病理情况、Masson胶原三色染色以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase-2，9，MMP-2、9）免疫组织化学染色等指标，摸索口腔溃疡的病理机制，为今后的临床研究提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 盐酸利多卡因注射液，规格0.1g/5ml，山东华鲁制药有限公司。Masson三色染色试剂盒，北京环宇金鹰科技有限公司。免疫组化试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）。 1.2 实验动物 SD大鼠12只，体重180-200g，雌雄各半。 1.3 实验性口腔溃疡动物模型的制备 选取健康SD大鼠9只，固定后腹腔注射0.1g/5ml盐酸利多卡因注射液，待大鼠麻醉后，牵拉打开其口角，充分暴露颊粘膜。将含有60%的冰醋酸的棉球分别平置于大鼠左右两侧口角约1mm处颊膜上，灼烧时间30s，24h后肉眼即可见该处颊粘膜约3mm白色损害。 1.4 HE染色 造模第2、4、6天随机选取3只SD大鼠用颈部脱臼法处死。用眼科剪剪下两侧颊粘膜，修整后置入10%中性甲醛溶液中固定24h。后置入自动组织脱水机中梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。经组织切片（5μm）、摊片、捞片、烤片后，脱蜡至水。苏木精染色、盐酸分化、流水冲洗后酒精脱水，入伊红溶液染色。最后梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，置于显微镜下观察。 1.5 Masson染色 组织切片常规脱蜡至水，按照试剂盒上推荐的步骤，先将切片放入苏木素溶液中染色，酒精分化后水洗，用Masson复合染液染色5-10min，酸洗分化后亮绿SF染色，最后经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片等步骤后，光镜下观察染色组织情况。 1.6 免疫组化法 采用免疫组化SP法，按试剂盒说明书进行染色，以PBS代替一抗作为空白对照。即切片脱蜡至水后，经内源性过氧化物酶灭活、抗原修复、血清封闭、一抗4℃过夜，二抗37℃ 30min孵育后，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，DAB/H2O2反应染色。苏木素复染、常规脱水、透明、干燥、封片。 2 结果 2.1 HE染色结果 正常组上皮层完整，固有层仅有少量炎性细胞浸润，实验性口腔溃疡组与正常对照组相比，造模第2天上皮层出现破溃区，固有层有大量炎性细胞浸润，渗出明显；第4天，缺损区域不同程度缩小，固有层仍有大量炎性细胞浸润；第6天，有部分样本上皮已恢复连续性，缺损未消失者，上皮有大量纤维增生。 2.2 Masson染色结 正常组染成蓝色的胶原纤维比较完整，数量较多，而实验性口腔溃疡组第2天染成蓝色的胶原纤维排列较紊乱，纤维细而短，数量少，直到第6天，胶原排列仍紊乱，只是数量增多。 2.3 免疫组化染色结果 两组切片中基底膜附近细胞胞浆中均可见MMPs的表达（染色为黄色），只是实验性口腔溃疡组染色更深，范围更大，特别在造模第2天，表现尤为明显，第4至6天，染色范围逐渐缩小，颜色逐渐变浅。 3 讨论 口腔溃疡病损的病理变化早期表现为黏膜上皮细胞及细胞间水肿，上皮内及血管周围有密集的炎症细胞浸润；随后上皮溶解、破溃、脱落，形成溃疡。溃疡表面有纤维素性渗出物形成的假膜或坏死组织覆盖，固有层内胶原纤维水肿变性、均质化或弯曲断裂、甚至破坏消失[1]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一组在结构上具有极大同源性、能够降解细胞外基质（包括基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶等）的蛋白内肽酶的总称。根据作用底物以及片断同源性，将其分为5类，为胶原酶、明胶酶、基质降解素、膜型MMP和其他类MMP[2]。MMPs参与许多正常生理过程，如胚胎发育、器官形态发生、骨重建、伤口愈合、细胞凋亡等，还参与炎症、心血管疾病、牙周病、溃疡、肺气肿、肿瘤的侵袭及转移等病理过程。其中明胶酶，包括MMP-2、9，主要降解Ⅳ型胶原和层黏连蛋白（基底膜的骨架），前者作为屏障起到阻止炎症细胞浸润和炎症扩散的作用。本实验Masson染色结果显示口腔溃疡的发生过程中确实有细胞外的基质成分（胶原）和基底膜的降解，其病理变化主要为非特异性炎症，且连续切片的免疫组化染色结果显示基底膜附近和固有层均有MMPs的表达，与对照组相比，染色更深、范围更广，据此可以推测MMP-2、9与口腔溃疡时基底膜的降解关系密切，与康媛媛[3， 4]等研究结果一致。据此，寻找、开发MMPs人工合成抑或天然的抑制剂，有望在不久的将来预防口腔溃疡的发生或者促进其快速愈合，减轻患者的痛苦。 参考文献 [1] 陈谦明，周曾同.口腔黏膜病学.人民卫生出版社. [2] 施琳，王关东.基质金属蛋白酶及其组织抑制物与口腔癌关系的研究进展.口腔颌面外科杂志，2005. [3] 康媛媛，张英.MMP-9在复发性阿弗他溃疡中的表达及意义.实用口腔医学杂志.2008. |
|
|
