冰箱(海尔公司，中国)，脱水机(天津天利航空机电公司，中国)，组织包埋机 (型号：BMJ-A型，常州中威电子仪器厂，中国)，切片机(型号：RM2235，莱卡公司，德国)，OLYMPUS 高分辨率相机，OLYMPUS 光学显微镜等。Ⅰ抗：骨形态发生蛋白(BMP)-2 抗体,PB0727；转化生长因子(TGF)-β1抗体,BA0290；血管内皮生长因子(VEGF)抗体，PB0084(武汉博士德公司，中国)。Ⅱ抗：GTVision Ⅲ抗鼠和(或)兔通用型免疫组化检测试剂盒(基因科技上海有限公司，中国)。
收集2015 年8月至 2016年4月西安交通大学附属红会医院创伤骨科收治的骨不连患者标本30例。其中萎缩性骨不连15例，肥大性骨不连15例；男24例，女6例；年龄21～71岁，平均46岁。病例纳入标准：①9个月内骨折未愈合，且连续3个月X线提示无明显骨折生长迹象[6]；②自愿参与此项研究，术前签署知情同意书者。病例排除标准：①有吸烟史；②有糖尿病、代谢性疾病、免疫性疾病或心脑血管疾病等病史[7]；③长期使用免疫抑制剂或非甾体抗炎药[7]；④感染性骨不连。
术中暴露骨不连断端，清除瘢痕组织及硬化死骨并留取标本。瘢痕组织多色泽灰暗，质地柔软，外观似鱼肉样；硬化死骨多白如象牙，质地坚硬，钻孔无出血。后取2.0 mm克氏针于断端两侧有明显哈佛管处钻孔，新鲜血液渗出即辣椒征阳性[8]，留取此处标本视为正常骨组织。所有标本编号，置入4%多聚甲醛固定液，于4℃恒温冰箱中保存。
①标本常规脱钙、石蜡包埋、 HE染色并光学显微镜下组织学观察。②按照操作程序：对标本进行处理和免疫组化染色,显微镜下观察。并用高分辨率相机随机选取5个部位进行拍照，每个视野计数100个细胞。
BMP-2和TGF-β1由2名病理医师独立计数，根据其阳性细胞数量所占百分比及染色强度进行评分。阳性细胞所占百分比：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度分为：无着色0分，黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。2项评分相乘结果：0～1分为阴性，2～4分为弱阳性( )，5～8分为中度阳性( )，9～12分为强阳性( )。VEGF使用Chalkley血管计数法，计算每个标本的微血管密度(MVD)。
将瘢痕组织及硬化死骨定义为成骨失活区组，正常骨组织定义为成骨活跃区组，比较2组结果是否存在统计学差异。数据釆用SPSS 19.0(IBM公司，美国)统计学软件进行处理，BMP-2和TGF-β1的表达量为等级资料，采用秩和检验，VEGF的表达量为计量资料，采用t检验。P<0.01为差异有统计学意义。
共纳入103例萎缩性骨不连，男75例，女28例；年龄22～68岁，平均45岁。其中胫骨干34例，股骨干57例，肱骨干11例，桡骨干1例；骨不连病程6～156个月，平均17.6个月；骨不连手术次数1次91例(使用钢板51例、使用髓内钉34例、使用外固定架6例)，手术2次12例(使用钢板 钢板8例、使用外固定架 钢板2例、使用髓内钉 钢板1例、使用钢板 植骨1例)；骨缺损范围1～4 cm。
患者取仰卧位，根据骨不连部位选取手术切口，以Judet骨膜剥离技术[9]显露断端，尽量保护周围软组织及骨膜，取出原内固定物，矫正肢体力线及长度，动力加压锁定接骨板桥接固定，两端至少各固定6层皮质。之后按照“成骨能力区域划分”概念处理断端，具体方法如下：彻底清除断端瘢痕组织及硬化死骨(成骨失活区)，于前侧皮质横跨断端开槽，开槽范围至远、近端正常骨组织(成骨活跃区)，有明显新鲜血液渗出即辣椒征阳性为宜，测量骨槽长度并取相应带皮质髂骨，修整后填充至骨槽内，骨缺损处填充松质骨颗粒。如植骨范围过大，于植骨块前侧附加重建接骨板，两端至少各固定4层皮质。
术后留置引流管，保持通畅引流24～48 h。第2天开始通过持续被动活动(CPM)仪进行功能锻炼，第3天开始主动功能锻炼。定期复查X线，显示有外骨痂形成后开始半负重锻炼，显示骨性愈合后开始全负重锻炼。
①骨愈合时间。临床骨愈合标准[10]：患处无压痛及纵向叩击痛，未见患肢异常活动，X线显示骨折线模糊或连续性骨痂，上肢可平举1 kg重物持续1 min，下肢可不扶拐平地持续行走3 min。②并发症。包括感染、钢板断裂和取骨区疼痛等。③术后综合评估，包括骨性评估及功能评估[11]。骨性评估指标包括骨愈合、感染、成角畸形及肢体短缩，优：骨愈合 无感染、成角畸形<7°、肢体短缩<2.5 cm；良：骨愈合 以上其他3项中任意2项；较差：骨愈合 以上其他3项中任意1项；差：骨折未愈合。功能评估指标包括跛行、关节僵硬、肌肉萎缩和功能障碍，优：活动自如 无以上任意1项；良：活动自如 以上任意1～2项；较差：以上任意3～4项；差：不能自主活动。
成骨失活区中骨细胞结构多不完整，可见空旷的骨陷窝，线粒体呈肿胀、溶解状，细胞膜部分溶解、消失；成骨活跃区中骨细胞质量均完好(图1)。
不论是肥大性骨不连还是萎缩性骨不连，BMP-2 、TGF-β1在成骨失活区中的表达均低于成骨活跃区，差异有统计学意义(P<0.01，表1～4)。
不论是肥大性骨不连还是萎缩性骨不连， VEGF在成骨失活区中的表达均低于成骨活跃区，差异有统计学意义(P<0.01，表1～4)。
图1 标本切片组织学观察，光学显微镜(HE染色×40) A 瘢痕组织 B 硬化死骨 C 正常骨组织
表1 肥大性骨不连标本BMP-2，TGF-β1和VEGF-MVD在瘢痕组织与正常骨组织中的比较
注：BMP-2，Z=4.83，P=0.00，2组间差异有统计学意义；TGF-β1，Z=4.81，P=0.00，2组间差异有统计学意义；VEGF-MVD，t=14.702，P=0.00，2组间差异有统计学意义
表2 肥大性骨不连标本BMP-2，TGF-β1和VEGF-MVD在硬化死骨与正常骨组织中的比较
注：BMP-2，Z=4.13，P=0.00，2组间差异有统计学意义；TGF-β1，Z=3.81，P=0.00，2组间差异有统计学意义；VEGF-MVD，t=4.48，P=0.00，2组间差异有统计学意义
表3 萎缩性骨不连标本BMP-2，TGF-β1和VEGF-MVD在瘢痕组织与正常骨组织中的比较
注：BMP-2，Z=4.478，P=0.00，2组间差异有统计学意义；TGF-β1，Z=4.478，P=0.00，2组间差异有统计学意义；VEGF-MVD，t=11.009，P=0.00，2组间差异有统计学意义
表4 萎缩性骨不连标本BMP-2，TGF-β1和VEGF-MVD在硬化死骨与正常骨组织中的比较
注：BMP-2，Z=4.916，P=0.00，2组间差异有统计学意义；TGF-β1，Z=5.089，P=0.00，2组间差异有统计学意义；VEGF-MVD，t=8.687，P=0.00，2组间差异有统计学意义
所有患者均获得随访，随访时间6～16个月，平均10.5个月。单钢板固定24例，双钢板固定79例，102例获得骨愈合，骨愈合率99%，骨愈合时间5～14个月，平均7.4个月。骨骼评分及功能评分优良率100%，其中17例跛行步态，13例踝关节僵硬，23例患肢肌肉明显萎缩，但均自主活动良好，未予以特殊处理。1例失败病例为术后6个月钢板断裂，CT显示骨不连断端无生长迹象，分析原因为植骨范围不充分，再次手术仍采用同样方法，术后8个月获得骨愈合。典型病例见图2、3。
随着科技的发展，大量国内外文献报道了以BMP-2治疗骨不连的案例[12-13]。然而，自体髂骨植骨仍是治疗骨不连的金标准。多项回顾性研究表明：自体髂骨植骨治疗骨不连的治愈率(85.1%)明显高于BMP-2(68.4%)，且BMP-2联合自体髂骨植骨治疗骨不连的治愈率与单纯自体髂骨植骨相比，无明显差异[14-15]。自体髂骨的优势在于其骨生成性、骨诱导性及骨传导性[16]。骨生成性是指其具有成骨能力的骨细胞；骨诱导性是指其具有促进骨细胞分化和生长的活性因子；而骨传导性是指其具有承载和运输这些骨细胞及活性因子的骨基质。然而，如何将此3大成骨效应发挥到最大程度？植骨块的位置选择具有决定性的作用。Marx等[17]研究发现：植骨块位于长骨干末端(接近松质骨)的爬行替代速度明显快于长骨干中段(接近皮质骨)，且植骨块必须与宿主骨充分接触。众所周知，松质骨由于其特殊的孔隙结构，允许营养的分散及微血管的吻合，较之皮质骨具有更强的成骨能力[18-19]。由此可以得出结论：当植骨块位于成骨能力更强的区域时，能发挥更强的成骨效应。
本文作者于2012年首次提出“成骨能力区域划分”假设：骨不连断端经历复杂的病理演变后，不同区域和不同组织间成骨能力不尽相同，植骨块应远离成骨失活区域，与成骨活跃区域充分接触，才能最大程度地发挥自体骨成骨效应。成骨区域划分标准如下：①术前X线：成骨活跃区多表现为骨密度正常，无骨萎缩及缺损，有明显骨痂形成，常位于断端两侧接近正常骨部分；成骨失活区多表现为骨密度增高，骨萎缩及缺损，无骨痂形成，常位于断端中间。②术中大体病理：成骨活跃区多骨质色泽鲜红，大体可见哈佛管，有骨痂形成；成骨失活区多骨质色泽灰白，未见哈佛管，无骨痂形成。③术中出血：成骨活跃区辣椒征阳性；成骨失活区辣椒征阴性。
图2 患者，男，47岁，股骨干骨不连 A 术前X线示骨折未愈合 B 术后X线示双钢板垂直固定，植骨充分 C 术后10个月X线示骨折线模糊，新生骨痂愈合良好 D、E 术后膝关节活动度：伸0°，屈曲120° F～J 术中植骨过程
图3 患者，男，35岁，股骨干骨不连 A 术后6个月钢板断裂 B CT显示骨不连断端无生长迹象，考虑原因为植骨范围不充分
然而，这种划分是否合理？本文作者于2011年取材48例断端瘢痕组织、硬化死骨及正常骨组织，术后送病理电镜观察进行验证，结果表明：成骨活跃区中的成骨细胞数量明显大于成骨失活区，成骨失活区内主要以成纤维细胞为主，差异有统计学意义[5]。
但是，单一通过骨细胞数量来判断成骨区域划分是否合理还远远不够。成骨活性因子及骨基质同样重要，且血管是以上3种因素发挥作用的前提[20-21]。成骨活性因子种类繁多，其中BMP-2和TGF-β1最受关注。成骨活性因子能够促进骨母细胞的繁殖，并分化成具有成骨能力的骨细胞[22]。骨基质为所有成骨活动提供生长平台，如果没有新生血管的建立，就不会有活性因子及骨细胞被源源不断地输送到骨不连断端，也就不会有成骨的过程。因此，为进一步证实成骨区域划分的合理性，本研究取材断端不同组织，通过免疫组化分析不同区域间活性因子及血管密度的差异性。结果表明：不论是肥大性骨不连还是萎缩性骨不连，成骨失活区中BMP-2，TGF-β1和VEGF的表达均明显低于成骨活跃区，差异有统计学意义(P<0.01)。韩昕光等[23]曾通过制作兔肥大性骨不连模型观察不同区域的成骨能力，结果表明：骨不连愈合端含大量新生骨组织及血管，骨不连断端主要为纤维瘢痕组织，BMP-2含量存在显著差异，与本研究结果相似。
因此，可以对“成骨能力区域划分”概念进行明确定义，成骨失活区是指骨密度增高，局部质地坚硬，有少许失活的成骨细胞及新生血管，大多被成纤维细胞覆盖，缺乏BMP-2 和TGF-β1等活性因子的区域；成骨活跃区是指骨密度正常，有明显哈佛管，有大量活性良好的成骨细胞、新生血管及活性因子的区域。自体骨植骨应充分跨越成骨失活区，桥接两侧成骨活跃区，并辅以坚强内固定，从而促进骨不连的愈合。
本研究纳入病例103例，术中均依照“成骨能力区域划分”概念进行植骨，获得了良好的临床疗效。骨愈合率99%，高于更换髓内钉的76%～98%[24]，平均骨愈合时间7.4个月，长于更换髓内钉的29.75周，与髓内钉附加钢板的7.2个月基本一致[25-26]。骨骼评分及功能评分优良率100%。其优越性主要体现在以下几点：①跨越成骨失活区，有利于发挥自体骨的3大成骨效应。成骨失活区主要由断端瘢痕组织及硬化死骨组成，瘢痕组织中既无丰富的成骨细胞，也无活性因子的募集和诱导，骨矿化过程极其缓慢，无法完全发挥自体骨的骨生成和骨诱导作用，同时，瘢痕组织夹杂在骨不连断端之间，会阻碍自体骨输送营养成分的骨传导作用。而硬化死骨本身缺乏成骨能力及新生血管，需要在自体骨诱导作用下经历破骨、再血管化和成骨等多个步骤方能发挥骨传导的作用，严重阻碍了骨愈合进程。②桥接两侧成骨活跃区，使宿主骨的血管、骨细胞及活性因子源源不断地通过自体骨被输送至骨不连断端，此时的自体骨更像是桥梁，加之自身的成骨效应，使骨愈合进程事半功倍。③提供力学稳定性。当自体骨植入成骨活跃区时，宿主骨已具有丰富的哈佛管排列，无需破骨细胞的侵蚀及哈佛管的重建，即可迅速与植骨块进行重新血管化，与植骨块早期相容，提供坚强的力学支撑，从而避免早期植骨块松动。同时结构植骨可以起到“房梁支撑”的作用，重建内侧骨皮质，有利于内侧骨缺损的局部稳定。本研究仅有1例失败，术后6个月钢板断裂，CT显示断端无明显生长迹象，仔细观察可以发现：自体骨的近端区域骨密度正常，骨痂生长旺盛，已与宿主骨紧密相容，而自体骨的远端区域骨密度增高，无明显骨痂，且与宿主骨之间存在间隙，说明植骨范围仍不充分，未与远端成骨活跃区紧密接触，这也从反面证明了植骨区域的重要性。
需要说明的是，在改善生物环境的同时，不应忽视力学稳定的重要性。本研究中有79例采取双钢板固定，因为只有稳定的内环境才能保证正常的成骨活动及再血管化。按照“成骨能力区域划分”概念植骨，势必要求植骨范围充分，而外侧单钢板固定尽管可以通过动力孔或者加压装置达到骨不连断端间有效加压，仍然无法满足前侧植骨块的稳定，使得早期植骨块移位，内侧张力增高，应力集中，最后导致钢板断裂。而双钢板垂直固定技术可以提供骨不连修复过程中最适宜的绝对稳定环境[27]，在外侧钢板基础上前侧附加钢板可以有效防止植骨块移位，同时使植骨块与宿主骨之间充分接触。
总之，骨不连断端不同区域间确实存在成骨能力的差异，根据不同成骨能力可以划分为成骨失活区(瘢痕组织、硬化死骨)和成骨活跃区(两侧正常骨)，自体骨植骨应充分跨越成骨失活区，桥接两侧成骨活跃区，使之紧密接触，必要时附加钢板增加局部力学稳定性，最大程度发挥自体骨的成骨效应，提高骨不连的治愈率。
参 考 文 献 略
