|
图片来源：网络 长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是一类本身不编码蛋白,长度在200-100000nt之间的RNA分子的长链非编码RNA分子。 lncRNA的作用机制非常复杂，例如细胞核中的LncRNA可以通过直接与靶基因结合来激活或抑制靶基因的表达，还能通过参与组蛋白修饰或募集转录因子而参与基因的表达调控；而细胞质中的LncRNA也可以作为一种竞争性内源性RNA与miRNA相互作用，参与靶基因的表达调控。那么，我们在选定了一个lncRNA的时候如何确定它是在细胞核还是细胞质中起作用？ 在确定一个lncRNA在细胞中的定位我们可以通过RNA的免疫荧光原位杂交也就是RNAFISH在细胞水平上对LncRNA进行定位。 进行FISH之前我们也可以通过数据库去预测我们的lncRNA在一些细胞系中的定位，给我们的实验做一个参考。在此介绍一个亚细胞定位的数据库： lncATLAS（http://lncatlas./） 该数据库是以15个细胞系的高通量测序数据为基础，收录了来源于GENCODE注释的6768个lncRNA数据。 首先打开数据库： 输入框中输入lncRNA的名称或者ID号，或者直接选择给出的lncRNA，再点击GO就可以获得数据库中收录的lncRNA的亚细胞定位。 以MALAT1为例来展示lncRNA的定位查询： 在框中输入lncRNA名称MALAT1 可以看到MALAT1在大部分细胞中定位于细胞核中 另外，还可以同时在下方选择增加一些RNA作为参考 可以看到MALAT1和TUG1在给出的细胞系中几乎都是位于细胞核，而H19则在大部分细胞中位于细胞质中，在少数细胞中位于细胞核中。 在对MALAT1在细胞中的定位有了一个初步的判断之后，则需要用RNA的免疫荧光原位杂交验证lncRNA在细胞中的定位。  简单介绍RNA FISH： 免疫荧光原位杂交是将已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交,从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。 RNA FISH的第一步就是进行探针的制备，RNA探针制备首先是一段与目标RNA互补的序列，RNA探针通常需要选择与目标RNA上的特异序列互补的片段以提高定位的准确性。 探针的标记方法可以分为直标法和间标法：直标法就是在RNA探针上直接标记荧光基团；间标法是在RNA探针上标记是生物素或者地高辛等，在标记的探针与细胞中靶标RNA结合后再通过与带荧光标记的二抗结合来达到使RNA复合体带上荧光信号的方法。 下图即为用生物素标记的探针进行免疫荧光原位杂交的过程： 图1 RNA FISH实验流程 （1） 探针制备：通过体外转录过程时RNA探针标记上生物素或者用末端标记法标记生物素，探针纯化回收备用。 （2） 细胞爬片或组织切片样本的准备：细胞爬片或组织切片样本经过固定-增加细胞膜透性-脱水等处理。 （3） 探针与细胞靶标RNA杂交：探针通过碱基互补与细胞内的靶标RNA结合。 （4） 耦合荧光链霉亲和素：杂交的RNA-生物素用带荧光标记的链霉亲和素孵育与生物素结合使靶标RNA带上荧光。 （5） DAPI复染：使用DAPI使细胞核内的DNA带荧光以区分细胞核和细胞质部分。 （6） 荧光显微镜或共聚焦显微镜观察荧光信号位置和拍照保存。 细胞lncRNA的定位如下图所示的lncRNA BCAR4位于细胞核中，以β-actin mRNA作为阳性内参，以无序的SCR序列为阴性内参。 图2 lncRNA BCAR4 的细胞定位 免疫荧光原位杂交方法除了可以对单个RNA进行细胞内定位，还可以通过LncRNA与miRNA的双RNA共定位研究LncRNA与microRNA的互作，以及RNA-蛋白的共定位研究LncRNA与蛋白的互作。 图3-1 lncRNA与miRNA的双RNA共定位
图3-2 lncRNA OLA1P2与蛋白p-STAT3的细胞共定位
|
|
|
