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反式白藜芦醇（RSV）是一种天然化合物，具有保护神经和心血管系统、抗炎和抗癌作用。细胞培养研究果显示，RSV能预防过氧化氢和紫外线诱导的氧化损伤。RSV还能在细胞水平对大量生理路径产生调节作用，尤其是对抗癌和抗老化防护作用的调节。在动物模型研究中，RSV同样显示出抗环境应激的防护效应。例如在SKH1裸鼠的研究中发现RSV能够减少UVB诱导的皮肤水肿、炎症和增生；在有光诱导肿瘤发生倾向的p53+/- SKH1裸鼠研究中还发现RSV能够延迟UVB诱导的皮肤肿瘤发生。RSV还可通过触发特异性信号通路产生防护效应，尤其是KEAP1-Nrf2通路。在RSV对皮肤的防护作用中，Nrf2的参与已在体外细胞培养研究中被证实，但尚未在体外重建皮肤模型和人原代角质形成细胞中得到证实。因此，该研究在正常人角质形成细胞（NHK）的原代培养体系和体外重建皮肤模型中，探讨RSV对Nrf2通路激活和谷胱甘肽（GSH）合成的影响，以及其抵抗氧化应激的有效作用。 白藜芦醇诱导皮肤抵抗氧化应激：从Nrf2的激活到谷胱甘肽的生物合成 Soeur J, Eilstein J, Léreaux G, et al.  1. 无毒性浓度下RSV可促进Nrf2蛋白的稳定和核聚集 该研究使用硫辛酸作为激活Nrf2的阳性对照。MTT分析结果显示，10 mM和20 mM的RSV或250 mM的硫辛酸处理24 h，未观察到NHK有任何毒性反应。同样，在经100 mM RSV和250 mM硫辛酸处理的体外重建皮肤模型中，也未观察到细胞毒性反应，RSV没有对表皮的形态和活性造成影响。 为验证RSV是否激活Nrf2，用RSV或Nrf2诱导剂（硫辛酸）分别处理NHK细胞，随后用荧光显微镜分析抗Nrf2抗体。与未处理组相比，用RSV或硫辛酸处理NHK细胞16h后，细胞核内Nrf2蛋白含量增加。RSV诱导的Nrf2荧光增强发生在细胞核内（+30%），细胞质中没有增强。蛋白免疫印迹检测结果显示，20 mM和100 mM RSV处理的体外重建皮肤模型中，Nrf2蛋白水平增加。同样，在用10 mM和20 mM RSV处理的NHK总蛋白提取物中，Nrf2蛋白水平也增加。这些数据表明，无毒性的低剂量RSV可有效激活Nrf2，且可能是通过Nrf2蛋白的稳定和核聚集来促进Nrf2水平的增加。 2. RSV可激活Nrf2靶基因的表达 定量RT-PCR结果显示，10 mM和20 mM RSV处理NHK细胞可诱导抗氧化酶基因（AOE）NQO1、GPx2和TXNRD1表达增加，还可以诱导谷胱甘肽代谢酶基因（GME）表达增加：XC-、GCLC、GCLM。在体外重建表皮模型中，20 mM RSV孵育条件下，可观察到表皮中NQO1、GPX2和TXNRD1的诱导；在100 mM RSV孵育条件下，可观察到NQO1表达增加，GME基因也被诱导，GCLC和GCLM的表达增加相似，XC-被轻度诱导。GPx2、NQO1和GCLC蛋白表达水平证实了RSV对NHK细胞和体外重建皮肤模型表皮中基因表达的诱导。 该结果表明，RSV在无毒性浓度下可有效激活NHK和体外重建皮肤模型Nrf2信号通路。 3. RSV可通过Nrf2的活化促进GSH的生物合成 RSV对GME基因和蛋白的诱导表明，RSV可能会刺激GSH的生物合成。在RSV处理NHK或体外重建皮肤模型16 h前后，分别定量检测GSH的浓度。结果显示，NHK和体外重建皮肤模型表皮内GSH含量均增加。L-[13C6,15N2]胱氨酸标记的体外重建皮肤模型，与未处理组相比，RSV处理的表皮中同位素标记的GSH浓度增加，证实RSV可以刺激GSH的生物合成。而未标记的GSH也增加，且增加比例与那些标记的GSH相似，推测或许是含硫氨基酸的原位再循环。在NHK和体外重建皮肤模型中，硫辛酸可促进GSH的合成。 该研究还通过NHK中Nrf2基因表达沉默来探讨RSV刺激GSH生物合成与Nrf2激活之间的关系，同样证实RSV能够通过激活Nrf2信号通路刺激NHK中GSH的生物合成。 4. RSV可增强表皮对过氧化氢的耐受性 由于RSV能够刺激AOE/GME基因表达和GSH的生物合成，因此推测RSV具有抗氧化应激作用。该研究使用库曼过氧化氢（CHP）对假设进行验证，结果发现，CHP（800 mM）可以导致表皮内GSH的浓度降低一半，而用20 mM RSV预处理后，表皮中的GSH能维持在一定水平，100 mM的RSV处理可使GSH增加200%。HES染色和TUNEL法对体外重建皮肤模型横切面进行形态评估，发现RSV预处理（20 mM或100 mM）完全能够阻止CHP对模型形态学造成的损伤和真表皮连接部细胞的大量死亡。同样，TUNEL分析结果显示，硫辛酸与RSV具有相似的保护作用。 为了提高自我防护能力，哺乳动物细胞具备了适应氧化应激的生理学通路。在这些通路中，转录因子Nrf2可被氧化和电应激激活。目前已证明Nrf2通路在皮肤中具有活性，许多研究也已证实Nrf2在皮肤病学领域的重要意义。 有报道一些植物提取物可在不同类型的细胞（包括皮肤细胞）中刺激Nrf2通路来增强抗氧化和解毒的能力，其中天然化合物RSV被报道是一种强效Nrf2诱导剂，具有高效抗氧化和解毒能力。我们的研究为阐明其潜在机制提供了新数据，并首次在体外重建全层皮肤模型中对RSV进行了研究。结果显示，RSV能够促进NHK培养物Nrf2 的稳定和核聚集，增加下游基因和相关蛋白的表达。在低浓度（20 mM）且无细胞毒性条件下，RSV可诱导某些Nrf2下游基因（NQO1、GPx2、TXNRD、GCL）的转录和蛋白质NQO1、GPx2和GCLC水平的增加。但RSV是如何影响皮肤中不同的信号通路并激活Nrf2还需进一步研究。 该研究数据也充分支持内源性抗氧化皮肤防御刺激的观点。发现RSV对表皮内GSH状态的影响非常明确，且GSH在体外重建皮肤模型中的代谢与人体皮肤的体外情况接近。结果显示，RSV能够诱导参与GSH合成相关基因的表达，使其含量显著增加。抑制Nrf2可以明显降低NHK中GSH的含量，凸显了Nrf2在表皮GSH代谢中的作用。结果还表明，GSH含量和AOE/GME表达协同增加，能为表皮提供超强的抵抗CHP诱导的氧化应激毒性损伤的能力。而经RSV预处理的表皮可以免受细胞损伤（尤其是在真表皮连接部），并可以对抵御CHP导致的GSH降低。 综上，RSV能够为皮肤提供高效的保护，尤其是在抵抗不良环境的影响方面。事实上，在污染严重的城市大气中（协同光损伤），预防且合理使用RSV，或激活Nrf2通路可能会提高皮肤对过氧化反应副产物的抵抗力及解毒作用。就RSV而言，应该考虑到其在紫外线照射下的光不稳定性。反式RSV对光极为敏感，能够被异构为顺式RSV。有研究报道，RSV对UVA处理的人角质形成细胞具有潜在的光毒性。广谱且具备光稳定的防晒剂配方的使用能够有效滤除RSV吸收波段范围的UVA，避免上述副作用。 总之，该研究阐明了在预防氧化应激的有害影响中，刺激内源性抗氧化通路（如Nrf2）的潜在益处。该方法可以成为使用高浓度外源性抗氧化剂的替代法，特别是当皮肤长期处于不良的环境应激中。 [ 原文摘自Soeur J, Eilstein J, Léreaux G, et al. Skin resistance to oxidative stress induced by resveratrol: from Nrf2 activation to GSHbiosynthesis. Free Radic Biol Med, 2015,78:213-223.] 原研究单位：欧莱雅法国研发和创新中心 文章摘译：陈旭、周治君、孔佩慧 喜欢这篇文章，就在下面吧！ |
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