|
蛋白免疫印迹即Werstern blot，是将印迹技术与抗原-抗体反应的特异性相结合的检测技术，用于分离和检测生物标本中的某一特定蛋白。其基本原理实混合蛋白质样本通过凝胶电泳分离后，通过特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（NC膜或PVDF 膜）上，将针对待测蛋白的特异性抗体作用于滤膜上，利用抗体上偶联的酶降解底物在滤膜上生成有色沉淀物或化学发光产物，从而显示出待测蛋白的存在及量。 其实验过程可用下图表示，是不是很简单？ 现在我用图加文字描述具体的表达每一步的过程： 一、样本制备 1、样本的来源：细胞培养上清；细胞（胞浆蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白）；组织匀浆 2、不同样本有不同的提取方式：蛋白完全裂解液、RIPA、胞核/胞浆 3、蛋白的提取：（裂解前加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂使其终浓度为1mM） 4、蛋白定量 ：BCA检测法(灵敏度高，操作简单，常用)、Bradford 检测法、Lowry 检测法、UV测量、电泳检测 5、样本上样前的处理:蛋白提取液和SDS上样缓冲液（Loading buffer）以一定的比例上样 6、蛋白变性：95-100℃变性5分钟（为了能使抗体接触到抗原表位，必须将蛋白的三维结构打开，因此需要将蛋白变性，核蛋白要增加裂解液体积和超声破碎次数，煮样时间延长至10-15min） 二、上样与电泳 原理：裂解后的蛋白质样本经过高速离心去除不溶物后，再经SDS上样缓冲液95-100℃变性5分钟，使带有强负电荷的SDS与带有弱电荷的蛋白质结合，大量的SDS可掩盖蛋白质本身的电荷量，只显示SDS的负电荷，在pH8.6~pH8.8的Tris-甘氨酸不连续SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）系统中，蛋白质的电泳与自身电荷量无关，只和其分子大小有关，从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。 在进行上样之前我们需要先配置适合浓度的凝胶，具体流程看下图： 制胶过程注意： 1 玻璃板对齐后放入架中，把两侧的夹子卡紧。要使短玻璃靠外，长玻璃靠内。 2 然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶,灌胶前加水检漏。 3 配胶时最后一步加入TEMED后立即摇匀马上灌胶，灌胶时枪头沿着角加入，以免产生气泡。灌胶距离短玻璃板1-2cm高度即可。加水/无水乙醇封胶速度要慢，否则胶会被冲变型。 4当水和胶之间有一条明显的分界线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 5 按照前面方法制备浓缩胶，插入梳子，待胶凝固即可。注意：使梳子处于润湿状态，轻轻插入梳子，以免后续步骤梳子不易拔出而使胶孔变形无法上样。插梳子时要使梳子保持水平。 上样：一般每孔上样20-50ug总蛋白，100ng纯蛋白。根据胶的厚度不同，上样总体积也不同：一般来说，10mm的胶最多可上样20ul；15mm胶最多上样30ul。 电泳：浓缩胶80V；分离胶120V（100V也可），电压越大分离越快，电泳时间一般1-2 h，电泳至溴酚兰即将跑出胶即可终止电泳。 三、转膜 一般分为：湿式电印迹-最佳的转膜方法，半干式电印迹-可选的替代转膜方法，干式电印迹-有限灵敏度的转膜方法。 转膜时间的确定： 蛋白从胶到膜上的湿转是指夹子的黑面-海绵垫-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵垫-夹子的白面的三明治结构全部沉浸在缓冲液里。在此种方法里，电转PVDF膜是在淹没于含20%甲醇的缓冲液及冷却(冰浴)的条件下，70-100V 恒压/250-350mA恒流左右进行转膜。蛋白分子量越大电压/电流越大，所需转模时间越长。 转模注意事项： 1 采用PVDF膜时，必须先经甲醇激活后才能使用，最好将PVDF膜放置在少量甲醇中浸透1min，再用电转印液漂洗5min，最后浸在电转印液中约30分钟，即可用于转膜。 2 接触硝酸纤维素膜、胶和滤纸时，必须戴手套。 3 转膜时间不易过长，否则蛋白可能会移出硝酸纤维素膜。 4 大电流转印时，常常导致电泳液过热现象。故电泳应在具有冷却水循环电泳槽或冰浴内进行。 5 将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
四、封闭 对转印膜空白位点的封闭，一般采用异源性蛋白质或去污剂封闭整张膜，常用5%脱脂奶粉、0.5%-2%BSA、10%血清（马/羊）和0.2%Tween20等。脱脂奶粉是常用的封闭剂，通常使用TBST+5%的脱脂奶粉但不能与生物素化的抗体一起使用，此时可以用BSA。使用辣根过氧化酶（HRP）标记的检测系统，封闭液后续不加叠氮钠（抑制HRP）。在含有封闭液的平皿中，接触胶的那面膜要朝上。 五、抗体孵育与检测 孵育一抗：按要求用TBST/PBS稀释抗体，室温：1.5-2h，或者 4℃过夜。孵育二抗：抗体的标记一般有酶标和荧光标记两种，室温：1.5-2h。显影，主要有：酶促底物DAB显色法（是HRP的常用底物），增强化学发光法（ECL）,荧光二抗显影法。最后用凝胶成像系统检测。 |
|
|
