基于血清蛋白质组学技术研究刮痧干预腰椎间盘突出症的效应机制

　　目的:(1)运用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技术,研究刮痧对腰椎间盘突出症(Lumbar disc herniation,LDH)模型大鼠血清炎性细胞因子的影响。(2)运用血清蛋白质组学技术,研究刮痧对LDH模型大鼠血清差异蛋白表达的影响,从整体角度研究刮痧干预LDH的作用机制。方法:(1)将72只雄性SD大鼠随机分为模型组、假手术组、刮痧组,每组24只。模型组与刮痧组大鼠建立自体髓核移植非压迫性LDH模型,假手术组同样暴露右侧L5DRG,切断尾椎,但不做放置髓核处理。模型组与假手术组不予治疗,刮痧组于造模后第5天开始干预,隔日刮一次,3次为一个疗程,共刮3个疗程。分别于造模后刮痧前、第1疗程结束、第2疗程结束、第3疗程结束,共4个时间点观察各组大鼠痛阈,并收集大鼠外周血。每组每次随机取6只大鼠。ELISA检测大鼠白细胞介素1β(IL-1β),白细胞介素4(IL-4),白细胞介素6(IL-6),干扰素γ(IFN-γ),肿瘤坏死因子α(TNF-α)。(2)收集LDH模型组与刮痧组大鼠部分血清样本,分别为模型组1个疗程、模型组2个疗程、模型组3个疗程、刮痧组1个疗程、刮痧组2个疗程、刮痧组3个疗程,共6组,每组各6个样本。运用iTRAQ技术,探究分别在3个疗程中与刮痧干预相关的蛋白,进行包括分子功能、细胞组分与生物过程的GO(Gene Ontology)分析,运用IPA(Ingenuity(?)Pathway Analysis)数据库分析差异蛋白的重要信号通路和相互作用的信号网络。结果:(1)干预3个疗程后,与模型组比较,刮痧能升高LDH大鼠热痛阈值(P<><0.05),而对il-4水平无显著影响(p>0.05);IFN-γ/IL-4水平与大鼠热痛阈值呈负相关,刮痧可明显降低其水平。(2)①干预1个疗程后,刮痧组与模型组相比共鉴定出198个差异蛋白。GO分析共鉴定出10个分子功能,13个细胞组分和19个生物过程。在分子功能中排前三位的分别是结合(48%)、催化活性(22%)、分子功能调节(5%);在细胞组分中排名前三位的分别是细胞成分(28%)、细胞器(18%)、细胞器成分(14%);在生物过程中排名前三位的分别是细胞进程(19%)、生物调节(15%)、单生物过程(15%)。IPA分析共鉴定出306条信号通路,富集度较高的前10条信号通路分别为:FAK Signaling、Regulation of eIF4 and p70S6K Signaling、Actin Cytoskeleton Signaling、PI3K/AKT Signaling、Erythropoietin Signaling、IL-3 Signaling、LPS-stimulated MAPK Signaling、ERK/MAPK Signaling、Cancer Drug Resistance By Drug Efflux 和 Semaphorin Signaling in Neurons。差异蛋白主要涉及18个信号网络。②干预2个疗程后,刮痧组与模型组相比共鉴定出182个差异蛋白。GO分析共鉴定出11个分子功能,13个细胞组分和20个生物过程。在分子功能中排前三位的分别是结合(44%)、催化活性(21%)、分子功能调节(9%);在细胞组分中排名前三位的分别是细胞成分(27%)、细胞器(18%)、细胞器成分(13%);在生物过程中排名前三位的分别是细胞进程(16%)、生物调节(15%)、单生物过程(14%)。IPA分析共鉴定出245条信号通路,富集度较高的前10条信号通路分别为:Acute Phase Response Signaling、LXR/RXR Activation、Intrinsic Prothrombin Activation Pathway、Actin Cytoskeleton Signaling、FXR/RXR Activation、Lanosterol Biosynthesis、Ubiquinol-10 Biosynthesis(Eukaryotic)、Rac Signaling、Regulation of the Epithelial-Mesenchymal Transition Pathway 和Clathrin-mediated Endocytosis Signaling。差异蛋白主要涉及 13 个信号网络。③干预3个疗程后,刮痧组与模型组相比共鉴定出170个差异蛋白。GO分析共鉴定出10个分子功能,15个细胞组分和18个生物过程。在分子功能中排前三位的分别是结合(45%)、催化活性(25%)、分子功能调节(6%);在细胞组分中排名前三位的分别是细胞成分(27%)、细胞器(18%)、细胞器成分(13%);在生物过程中排名前三位的分别是细胞进程(20%)、生物调节(16%)、单生物过程(15%)。IPA分析共鉴定出245条信号通路,富集度较高的前10条信号通路分别为:LXR/RXRActivation、FXR/RXR Activation、5-aminoimidazole Ribonucleotide Biosynthesis I、Inhibition of Angiogenesis by TSP1、Melatonin Degradation II、tRNA Charging、Tetrahydrofolate Salvage from 5,10-methenyltetrahydrofolate、Tyrosine Degradation I、Serotonin Receptor Signaling 和Ceramide Biosynthesis。差异蛋白主要涉及13个信号网络。结论:(1)刮痧能抑制自体髓核引起的LDH大鼠血清促炎因子,并抑制机体Thl免疫,使机体Thl/Th2免疫失衡恢复到正常状态,从而减轻其疼痛。(2)刮痧干预后,LDH大鼠血清中众多蛋白的表达发生了改变,这些蛋白涉及众多功能,说明机体发生了广泛而复杂的变化。刮痧不仅可以调控与LDH相关的病理变化过程,亦可通过刺激生理变化过程达到治疗效果。不同的蛋白可能先后激活不同的通路来诱导机体产生应答反应,起到治疗效果,其中最主要的三条通路为:FAK Signaling、Acute Phase Response Signaling 和 LXR/RXR Activation。此外,刮痧可能通过调节 ERK1/2、NFκB 等信号通路,从而参与了细胞形态与器官形态、机体损伤与异常、神经系统发育与功能等信号网络。信号通路与网络分析提示差异蛋白主要参与炎症免疫、神经保护、维持细胞骨架动态平衡过程,Racl、Orml、Hpx、Gapdh、Hsp70、Htt等蛋白在这些过程中发挥了重要作用,可能作为潜在的靶点蛋白,为解释刮痧治疗LDH效应机制方面提供新的思路和依据。……