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摘要：二氧化氯是一种安全、高效的食品和饮用水消毒剂。二氧化氯通过氧化酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等氨基酸使蛋白质变，本文综述了二氧化氯与重要生物分子的作用以及二氧化氯在个体水平上对微生物的致死靶点等方面的研究进展，并指出二氧化氯的杀菌机理目前仍然存在较大的争议。
关键词：二氧化氯；作用机理；氨基酸；DNA；RNA；细胞膜 二氧化氯是一种安全高效的氧化型消毒剂，其氧化能力是氯气的2.5倍[1]。因其不与有机物发生取代反应而避免了产生三氯甲烷等致癌、致畸、致突变副产物，被视为传统氯消毒剂的换代产品[2]。目前已被应用的领域有饮用水和食品生产消毒[3,4]、医疗器械消毒[5]、藻类控制[6]、室内污染的消除和公共卫生控制等[7,8]。相对于二氧化氯的应用而言，对其作用机理的研究比较滞后。上世纪60年代以来，国内外的一些研究者分别以核酸、蛋白质、细菌、病毒和酵母菌等为材料研究了二氧化氯的杀菌机制。本文就二氧化氯杀菌机理方面的研究进展做一综述，以期更全面、深刻理解二氧化氯的作用实质，更有效地开发和利用这种优质消毒剂。 1 二氧化氯对重要生物分子的作用机制 在分子水平上阐明二氧化氯对生物大分子的作用机制是人们解释其杀菌机理的前提，也是科研人员一直以来的努力方向。作为一种非特异性的氧化型消毒剂，二氧化氯对微生物的致死靶点至今仍然存在很大争议。因此，扩大研究对象，阐明与细胞成分及生化过程相关的
一些重要的生物大分子与二氧化氯的反应机制对于全面、深刻理解二氧化氯杀菌机理具有重要意义。目前已从化学、物理等角度研究氨基酸、谷胱甘肽、还原型辅酶Ⅰ（NADH）、胞嘧啶、脱氧核苷三磷酸等重要分子在体外与二氧化氯作用的机制。 1.1
二氧化氯与重要生物分子的作用途径 1.1.1
对二氧化氯敏感的氨基酸和蛋白质 至今为止人们发现二氧化氯只和几种还原性的氨基酸发生反应。早在1967年Benarde等利用OD280的变化以及纸层析法均未能证明二氧化氯与蛋白质和游离氨基酸（组氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和亮氨酸）发生反应[9]。但Noss等在离体条件下将二氧化氯分别与19种氨基酸混合，发现有6种氨基酸表现出了与二氧化氯的反应活性（以二氧化氯消耗量表示），分别是脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和蛋氨酸。其中半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸的反应速度最快，其它三种反应速度太慢而似乎与微生物失活无关。即便是前三种敏感氨基酸，它们在天然和变性的病毒颗粒中与二氧化氯的反应活性差别很大。在f2病毒颗粒中，色氨酸和半胱氨酸被包埋在蛋白质结构的内部而难于与二氧化氯反应，而酪氨酸因为有一部分暴露在蛋白表面可被二氧化氯氧化。当病毒外壳蛋白被变性处理后半胱氨酸和色氨酸与二氧化氯的反应活性则显著提高[10]。 Ogata利用牛血清白蛋白（BSA）和酿酒酵母的6-磷酸葡萄糖脱氢酶为模型的研究进一步证实了二氧化氯对酶活性的破坏。10μmol/L的二氧化氯在15s内就能使6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性下降90%。研究发现被二氧化氯氧化的蛋白质α-螺旋的数量减少并且整合有来自二氧化氯的氧原子，确认了二氧化氯对色氨酸和酪氨酸的共价氧化，并且用质谱法分析了氧化的产物[11]。Ogata的研究在氨基酸水平上解释了蛋白质失活的机制，也证明了二氧化氯与蛋白质不发生涉及氯原子的取代反应。 迄今为止，以游离氨基酸、纯化蛋白、变性的病毒蛋白等材料开展的离体研究对于人们了解二氧化氯对生物细胞的氧化机制有很大帮助，但是由于敏感氨基酸在细胞的各个组分中广泛分布，因此二氧化氯对这些氨基酸的损伤并没有结构和酶的特异性，上述研究结果还难以解释二氧化氯在生理层面上发生损伤的顺序及其与细菌致死的关联度。 1.1.2
二氧化氯对DNA分子反应活性 作为遗传信息的载体，DNA在细胞物质的合成和遗传过程中具有重要作用。由于受到技术手段的限制，人们曾认为二氧化氯对DNA的损伤不明显[9]，但近年来的研究证明二氧化氯对DNA有实质的损伤作用。Napolitano等描述了二氧化氯与鸟苷一磷酸（5´-GMP的反应历程：鸟苷阴离子和二氧化氯反应生成鸟苷自由基，该自由基与第二个二氧化氯分子反应
生成加合物guanosyl-OClO，最终分解成咪唑啉酮和一氯咪唑啉酮[12]。韦明肯等发现75 mmol/L的二氧化氯使脱氧核糖核苷三磷酸混合物（dNTPs）的OD260下降54.23%以上，推测可能与嘧啶碱和嘌呤碱的共轭双键被破坏有关[13]，这与Napolitano报道的二氧化氯对5´-GMP的作用发生在鸟苷基团部分相一致。在DNA水平上，二氧化氯作用后的质粒作为聚合酶链式反应（PCR）模板的活性以及转化大肠杆菌的效率均有明显下降[13]。韦明肯的研究在物理特性和生理功能水平上支持了二氧化氯对DNA损伤的判断，但由于对DNA的损伤是在远高于正常消毒浓度时才比较明显，因此DNA损伤在杀菌作用中不是关键因素。 1.1.3
二氧化氯与重要生物分子的反应途径 二氧化氯与生物分子之间的反应途径有助于人们了解其杀菌的化学本质。一系列的研究表明，二氧化氯与酶和氨基酸的作用伴随有二氧化氯加合物（C(H)-OClO）的生成。初始底物（氨基酸）一般先与第一个二氧化氯分子发生仅涉及单电子转移的氧化反应，形成的中间产物接着与第二个二氧化氯分子发生氧化反应，生成的二氧化氯加合物经过一系列后续反应最后生成终产物。 色氨酸与第一个二氧化氯分子的反应产生了色氨酰自由基阳离子，接着去质子化形成中性的色氨酰基，并马上与第二个二氧化氯分子反应，生成一个短暂存在的以C(H)-OClO键连接的二氧化氯加合物，此加合物在一个涉及3电子的氧化反应中衰减生成次氯酸、N-甲酰犬尿氨酸（N-formylkynurenine， NFK）和其它产物[14]，终产物的种类与Ogata的报道相一致[11]。在二氧化氯与半胱氨酸（CSH）的反应中，可能的反应机制是一个电子从半胱氨酸转移到二氧化氯分子上，然后氧化型的半胱氨酸正离子基团（CS）与第二个二氧化氯分子反应，形成半胱氨酸-ClO2加合物（CSOClO）[15]。酪氨酸与二氧化氯反应产生的酚氧自由基快速地结合下一个二氧化氯分子，形成带有C(H)OClO键的短暂存在的加合物，然后迅速衰减生成多巴醌[16]。NADH则首先转移一个电子到二氧化氯分子，然后传递一个H给H2O，最后又转移一个电子给第二个二氧化氯分子，形成的产物包括两个ClO2−, 一个H3O+和一个NAD+[17]。上述研究报道显示形成二氧化氯加合物是二氧化氯氧化反应的一个共性特征。 1.2
pH值对二氧化氯与生物大分子作用的影响 pH值对二氧化氯的杀菌效果有明显影响。在pH6-9的范围内，pH值越高，杀菌效果越好，二氧化氯在pH8.0时对隐孢子虫卵的杀灭效率是pH6.0溶液的2倍[18]。这种杀菌效果的差异与不同酸碱度下二氧化氯的反应途径和速度不同有关。pH值影响着二氧化氯与色氨酸的反应级数：在pH＜5 时二氧化氯的反应为二级反应；pH＞5.0时，则呈一级反应[15]。在低pH值的条件下，二氧化氯与半胱氨酸的反应摩尔比是6:5，而在高pH值的条件下，反应摩尔比是2：10，因此在高pH值下氧化半胱氨酸的效率更高。在pH6.7时，二氧化氯与半胱氨酸的反应速度比与胱氨酸的快7个数量级[15]。在pH4-7的范围内，二氧化氯对酪氨酸的氧化反应速度随着pH值的增高而显著增大，并产生一系列的氧化产物[16]。了解pH值与二氧化氯氧化作用的影响可纠正国内部分人关于二氧化氯杀菌效果不受pH值影响的观点，有利于人们在实践过程中遵循规律，最大限度发挥其杀菌效用，。 2 二氧化氯对微生物个体水平的杀灭机理 二氧化氯对一些重要生物分子的作用机制为人们深入理解二氧化氯的杀菌机理奠定了理论基础。但是对于二氧化氯这种非特异性氧化型消毒剂而言，如何以离体的分子损伤事件解释具体的生理功能损伤，特别是找到细菌致死的首要靶标，并不是一件容易的事情。目前，以细菌、病毒和真菌为对象的二氧化氯杀菌机理研究均有报道，但其杀菌的致命靶点仍然存在很大争议。 2.1
二氧化氯对细菌作用机理研究进展 2.1.1
二氧化氯对细菌细胞屏障及其生理功能的损伤 传统的氯消毒剂（Cl2、NaClO等）对细菌的形态和结构均有比较明显的损伤，与此不同的是二氧化氯对细胞形态结构的破坏不明显[19-22]，因此二氧化氯不是通过破坏细胞形态结构的方式杀灭细胞。即使形态结构保持完整，但是二氧化氯的作用会造成膜的通透性增加，细胞内钾离子、镁离子和ATP等小分子物质大量泄漏[19,22]。值得注意的是，即使很高的二氧化氯浓度也不会造成细菌的DNA和蛋白质等大分子物质的大量漏出[9,23,24]。 Benarde用0.25mg/ml的二氧化氯作用于大肠杆菌5分钟，上清液在260nm和280nm处均没有吸收峰出现[9]；刘雪林以3H-TdR同位素示踪显示细菌的杀灭率达到97%以上时，DNA的漏出率几乎为零[21]。蛋白质的泄漏则不仅总量偏少，而且随着二氧化氯浓度的增高胞内蛋白泄漏量反而呈下降趋势，推测可能是高浓度的二氧化氯使细胞膜上的通道收缩所致[24]。虽然这些研究者都发现了小分子物质泄漏现象，但因为同时还伴随有酶失活等其它的损伤事件，所以认定小分子物质泄漏为细菌致死原因也难令人信服。 由于细菌没有细胞器，很多酶系分布在细胞膜上，膜的损伤不但表现为通透性增加，还伴随有酶的失活和生理功能的丧失。Berg 等对大肠杆菌的研究显示，二氧化氯造成大量的钾离子泄漏的同时，细胞呼吸被明显抑制，但在亚致死浓度下就出现了呼吸抑制现象，因此认为呼吸抑制对于细菌致死不如钾离子泄漏那么重要[19]。我们的研究发现二氧化氯作用的白色念珠菌细胞的内外结构保持完整，但是胞内的钾离子和ATP大量泄漏，细胞质膜电位消失并与死亡率有很高的对应性，提示虽然细胞膜没有明显的物理损伤，但是生理功能遭到严重破坏[23]。以原核生物为材料研究细胞膜损伤与杀菌的关系存在的一个缺陷是膜损伤和膜系酶损伤交织在一起而无法区分，如果以真核生物为材料则可有效避免此类问题。我们选用真核微生物白色念珠菌作为材料的研究表明抑制确实与死亡不同步，呼吸抑制率在不同的时间点始终低于菌体死亡率，并且厌氧和好氧条件下死亡率没有显著差异[25]，有力支持了之前Berg关于呼吸抑制不是二氧化氯杀菌首要靶点的判断。 二氧化氯对细菌生理的损伤还包括蛋白质合成抑制和酶失活。Benarde分别用14C标记的苯丙氨酸和缬氨酸掺入法，观察到了明显的蛋白质合成受阻现象，他推测是二氧化氯破坏了核糖体的结构，使之失去合成蛋白质的功能而致细菌死亡[9]。但Roller等以血友流感细菌（Haemophilus influenzae）作为材料的研究结果则显示总脱氢酶的活力被完全抑制时仍有部分细菌存活，最小致死浓度下蛋白质合成也只是部分被抑制，因此推测二氧化氯对细菌的致命靶点不是脱氢酶、也不是蛋白质合成，而是在其它方面[26]。刘雪林发现ATP酶的破坏和脂质过氧化物丙二醛的产量随着细菌死亡率的上升而增加，使人们对二氧化氯的细胞损伤作用的理解得到了延伸[27]。 2.1.2
二氧化氯对DNA的损伤 Young
等研究了枯草芽胞杆菌芽胞被二氧化氯作用的机理。野生型芽胞内具有α型及β型小分子酸性可溶DNA保护蛋白，研究表明这两种保护蛋白的的缺失突变体（α-β-）对二氧化氯的敏感性与野生型比没有明显差异。芽胞外壳是抵抗二氧化氯的主要屏障，二氧化氯可能是通过破坏芽胞内膜而使细胞使死亡[28]。韦明肯等的研究表明，只有很高浓度的二氧化氯才对离体质粒的PCR反应模板活性和转化大肠杆菌的效率产生显著影响，这或许也说明了对DNA的损伤可能不是杀灭细菌的主要靶标[13]。酿酒酵母D7双倍体菌株的试验发现仅在二氧化氯为5-10倍于实际水处理浓度的时才表现出对酵母的基因毒性[29]。 总之，目前在二氧化氯对细菌的致死靶点上难以得出排他性的结论，但相比之下，DNA对细菌致死的相关性比蛋白失活和膜通透性及膜电位的损伤要低。 2.2
二氧化氯对病毒作用机理研究进展 研究者对于核酸和衣壳何者是二氧化氯致死靶点一直存在争议。二氧化氯与氯气的显著不同在于，氯气会使脊髓灰质炎病毒的超显微结构发生变化，而二氧化氯则在没有造成形态损伤的情况下将该病毒杀灭[18]。目前已有研究证明了二氧化氯对病毒RNA有降解和抑制合成的作用。Alvarez等发现被碘和二氧化氯氧化的病毒外壳蛋白的等电点均从7.0下降到5.8，所不同的是被二氧化氯灭活的脊髓灰质炎病毒仍然能够正常吸附、穿透寄主细胞并起始脱壳作用，而碘灭活的病毒则失去了对宿主的吸附能力；另一方面，[14C]尿嘧啶示踪的RNA合成量明显下降，因此推测二氧化氯是通过破坏病毒RNA使其丧失模板功能，阻断了新RNA合成而使病毒失活[30]。Li等用ELISA、长距离步移RT-PCR法研究了二氧化氯杀灭甲肝病毒的机理，发现失活病毒基因组的5`端非编码区一个600碱基的RNA片段有缺失[31]。由于二氧化氯作用后甲肝病毒的灭活与其RNA5‵端非编码区的破坏相一致，李君文等认为可以用PCR法来检测甲肝病毒的灭活效果[32]。Simonet发现二氧化氯对病毒RNA的降解与对病毒颗粒的灭活均表现出浓度依赖性。二氧化氯对降解脊髓灰质炎病毒5′-UTR and 3′-UTR 末端的非翻译区具有偏好性 [33]。奇怪的是，二氧化氯对病毒DNA的损伤作用目前未见报道。 也有一些研究者认为蛋白质衣壳是二氧化氯的杀菌靶点。Noss也认为酪氨酸被氧化是噬菌体f2失活的主要原因，因为在二氧化氯作用下，酪氨酸残基的下降曲线和病毒活力的下降曲线趋势一致，虽然前者的速度要比后者慢得多[10]。 Hauchman 等发现f2噬菌体被二氧化氯灭活以后失去了对宿主的侵染力，但核酸仍然具有活性，由此推测病毒失活可能是因为蛋白质衣壳被破坏引起[34]。 3 总结和展望 目前二氧化氯在氨基酸水平上的作用靶点和氧化机制有了比较明确的认识，但是在生理结构和功能水平上至今仍然存在着很大的争议。只有将分子损伤放到结构与功能损伤的层面并与微生物的杀灭率相联系，才能比较全面地阐述二氧化氯的杀菌机理。
不同研究者对二氧化氯作用机理的研究结果不尽相同甚至得出互相矛盾的结论，可能与所选择的生物材料不同（不同的病毒或细菌种类）以及研究角度、检测方法、实验设备及条件不同有关。比如对核酸的损伤研究中，对于DNA的损伤主要以细菌为材料展开研究，而对于RNA的损伤主要以病毒为材料开展研究。目前未见有关于二氧化氯对病毒DNA或者对细菌RNA的损伤报道，也许二氧化氯对病毒和细菌的作用机制不同，对RNA病毒和DNA病毒的作用机制也不同。这都需要进一步扩大微生物材料的种类才能得出更全面、准确的结论。另外，人们不应该过度受到抗生素（具有明确靶点）作用机理研究思维的束缚，而是抓住其“非特异性氧化”的特征，从二氧化氯与微生物接触以及进入细胞的时空顺序特点出发来寻找致死靶点，或许会有新的突破。
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