河豚毒素

简介

河豚毒素一种存在于河豚、蝾螈、斑足蟾等动物中的海洋毒素。 　　

分子式C11H17N3O8。 　　

无色棱柱状晶体。对热不稳定。难溶于水，可溶于弱酸的水溶液。 　　

在碱性溶液中易分解，在低的pH值溶液中也不稳定。 　　

河豚毒素是强烈的神经毒素，很低浓度的河豚毒素就能选择性地抑制钠离子通过神经细胞膜。河豚毒素还有其他药理作用，是神经生理学和肌肉生理学研究的有用工具。 　　

河豚毒素(TTX)系小分子量非蛋白质神经毒素，河豚毒中毒后，潜伏期短、病死率高，吸收后迅速作用于末梢神经和中枢神经系统，使神经传导障碍，首先感觉神经麻痹，后运动神经麻痹，严重的脑干麻痹导致呼吸循环衰竭。

应用

河豚的种类很多。体长的河豚毒性相对高些，其组织器官的毒性强弱也有差异。河豚毒素从大到小依次排列的顺序为：卵巢、肝脏、脾脏、血筋、鳃、皮、精巢。冬春季节是河豚的产卵季节。此时，河豚的 肉味最鲜美，但是毒素也最高。随着科学的进步，令人恐惧的河豚毒素已步入了药学殿堂，并且在治疗人类疾病方面发挥着越来越重要的作用。河豚毒素在医疗上可以用于治疗癌症。'新生油'是从河豚肝脏中提取的抗癌药物。用于治疗鼻咽癌、食道癌、胃癌、结肠癌的治疗，疗效很好。

河豚可以用于镇痛。对癌症疼痛、外科手术后的疼痛、内科胃溃疡引起的疼痛，河豚毒素制剂均有良好的止痛作用。使用河豚素的好处是用量极少（只需3微克），止痛时间长，又没有成瘾性。特别是穴位注射，作用快、效果明显，可以作为成瘾性镇痛药吗啡和杜冷丁的良好替代品。河豚毒素还可以止喘、镇痉、止痒。河豚毒素可以治疗哮喘、百日咳。对治疗胃肠道痉挛和破伤风痉挛有特效。河豚毒素对细菌有强烈杀伤作用。从河豚精巢提取的毒素，对痢疾杆菌、伤寒杆菌、葡萄球菌、链球菌、霍乱弧菌均有抑制作用，而且可以防治流感。目前，在国际市场上，河豚毒素结晶每克已经高达17万美元。现在，河豚毒素已经可以人工合成了。 　　

最近，加拿大科学家却利用河豚毒素研制出一种能止痛的新型药物。这种新型特效止痛药能够有效地缓解癌症病人的疼痛。目前这个课题已经做完一期和二期的临床实验。在临床实验中医生每天给病人注射两次这种药剂，一次几微克，连续注射4天。当用药进入第3天后，患者的疼痛开始减轻。结果，有将近70％的病人的病痛得到缓解。研究人员还发现，最后一次注射停止后，止痛效果仍可延续。在一些病例中，止痛效果甚至可以延续15天。加拿大多伦多大学药理学教授爱德华·赛勒斯说，这种药物可以阻断发向大脑的有关疼痛的神经信号，其止痛效果比吗啡强3000倍。

研究

如《神农本草经》和《本草纲目》中都有河豚的记载。河豚学名：Fugn rubripes，属硬骨鱼纲，鲀形目，鲀亚目，鲀科，是暖水性海洋底栖鱼类，分布于北太平洋西部，在我国各大海区都有捕获，假睛东方豚还经常进入长江、黄河中下游一带水域，而暗纹东方豚亦可进入江河或定居于淡水湖中。 　　

TTX又称原豚素 ( spheroidine) 和东方豚毒素(fugu poison) ，是一种神经毒素，名字来源于动物东方豚属(fugu)河豚(spheroides rubripes)的科名Tet raodontidae 。 　　

河豚味道鲜美，营养丰富，日本、中国、欧洲等国人民素有食用习惯,由于TTX 毒性很强,因食用河豚中毒事件屡有发生。最初1909 年田原对河豚鱼卵的神经毒性进行了描述并命名其毒性成分为TTX 。1938年日本学者横尾晃，首次从河豚中提取出较纯的毒性成分,到1950 年才分离到单体结晶。随后日本津田恭介小组于1952 年，平田义正小组于1955 年，美国的Woodward 小组于1957年和后来的後藤小组相继分离得到了TTX 单体结晶。 　　

TTX 的分子并不大,其结构新颖,在有机溶剂和水中都不溶解, 仅溶于醋酸等酸性溶剂,并且在碱性和强酸性溶剂中不稳定,加之核磁共振技术在20 世纪60 年代刚刚开始应用,给TTX 的结构鉴定带来了相当的困难。为了确定TTX 的结构,日本的津田、平田和美国的Woodward 3 个小组分别制备了TTX 的衍生物并进行X2衍射实验。终于1964 年在京都召开的国际天然产物化学会议上同时报告了TTX 的正确结构,是一种分子量不大但结构很复杂的笼形原酸酯类生物碱,分子中几乎所有的碳原子均有不对称取代。同年Mosher 从产于加利福尼亚的蝾螈中也分离出TTX。1964 年以前日本和美国学者对TTX 的结构进行了深入的研究,报道了多个TTX 的可能结构和部分结构。

假说

1964 年以前,人们普遍认为TTX仅分布于东方豚中,直到Mosher 从产于加利福尼亚的加州蝾螈中分离出了TTX才改变了人们的认识。研究发现, TTX分布于陆地和海洋的许多动物中,包括毫不相干的脊椎动物,无脊椎动物的体内和体表,甚至海底沉积的生物中,如热带刺鲥鱼,蟾蜍,哥斯达黎加的箭毒蛙，蓝斑章鱼,多棘槭海星,马蹄形蟹,花纹爱洁蟹,腹足纲软体动物如硰罗法海螺,日本东风螺,环节动物以及其他的软体动物和线虫。 　　

既然TTX广泛分布于这么多种的生物体内，那么TTX的起源问题就引起了学者的关注。总结来看关于TTX起源问题，现在有四种假说。分别是内因说、外因说、食物链假说和微生物起源假说。

内因假说

　　主张内因说的学者认为河豚等含有的刺胞、毒腺中的蛋白质毒素是内源性毒素的来源。推测河豚鱼体内有特定功能或微生物能将摄入的食物转化为毒素。Matsumura 用人工授精法从河豚鱼( Fugu ni2phobles) 卵母细胞发育的胚胎中发现河豚毒素的毒性随胚胎发育不断增高,提出TTX 是河豚鱼胚胎的产物但始终没有更多证据证实这种说法,因此内因说没有得到广泛认可。

外因假说

　　外因说是日本学者清水、松居最早提出的。他们用含TTX 的饵料投喂养殖的无毒河豚及人工采苗饲育的河豚,结果发生毒化现象,推测毒素的起源可能是外因性的。

食物链假说

　　食物链假说是由桥本野口发现并提出的，他从海螺、海星及花纹爱洁蟹( A tergatisf lori dus) 检出高浓度的TTX,为食物链起源假说提供了证据。Noguchi 证实白法螺( B oshubora) 体内的毒素是进食了含TTX 的海星积累的,这是食物链假说的又一例证。但这些动物含毒程度为何因地区个体的不同有很大差别呢? 毒素起源于含毒饵料假说也有不少难以自圆之处。

微生物起源假说

　　松居提出了TTX微生物起源假说,但当时并无实验证据。微生物起源假说日本安元健从藻食性青点鹦嘴鱼中检出的毒素经氢氧化钠衍生后生成TTX 衍生物22氨基262羟甲基喹唑啉(C9 碱) ;对摄食石灰藻的铜铸熟若蟹的检测证实同样含TTX;而不摄食石灰藻的多毛纲动物也检测到TTX 衍生物,因此认为石灰藻并非原始产毒者,推测石灰藻上可能有共生细菌附着。

Nogu2chi 等由石灰藻和毒蟹的内脏分离的假单胞菌属(Pseudomonas) 细菌培养液中得到2个有毒成分,确证分别与河豚毒素及脱水河豚毒素一致,碱液分解也生成C9碱;高压液相,红外光谱、质谱分析确证是TTX;分别注射小鼠腹腔,显示了与河豚毒素和脱水河豚毒素相对应的致死率,从而证实TTX是细菌的代谢产物,这是TTX起源于共生微生物的最早证据。迄今已发现很多产TTX 的微生物类群。因此主张微生物起源假说的学者越来越多。 　　

1986 年日本学者野口和安元又首次从微生物发现TTX 。随后众多的微生物如弧菌属、假单胞菌属、发光菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属、芽胞杆菌属、不动杆菌属、链霉菌属等中发现了TTX 及其类似物,从而支持了Mosher 的假设。

活性

很多海洋食品中毒事件都与TTX 有关,河豚中毒是鱼类中毒中最为严重的一类,患者病死率高达60 %。 　　

TTX中毒的主要临床表现为知觉麻痹、运动障碍、头晕头痛、恶心呕吐、血压下降、呼吸困难、严重者因呼吸衰竭而死亡。TTX 还是麻醉剂, 其局部麻醉作用是普鲁卡因(procaine)的4000倍,可作为癌症后期的缓解药。TTX 的作用机理与陆地发现的毒素不同,极低的浓度就能选择性地抑制钠离子通过神经细胞膜，但却允许钾离子通过,，TTX 是一种电压敏感的钠通道(voltage2gated sodium channels ,VGSC)外口特异性阻滞剂，神经、肌肉、心肌传导纤维等可兴奋细胞膜生的钠通道，并具有高度专一性,其作用机制是通过与膜上的专一受体结合，再通过关启机制关闭通道,从而阻滞神经细胞的兴奋与传导。

作用机制　　

TTX 分子中1 ,2 ,32胍氨基及其附近的C4 ,C9 ,C10 碳上的羟基为活性基团。胍氨基在生理条件下通过质子化形成正电活性区域,与专一受体蛋白的负性羟基结合, 其周围羟基以氢键形式与受体结合,受体位于膜外层离子孔附近。

　　TTX 是神经生物学和药理学研究极为有用的工具药。TTX 还是一种较强的镇痛药,除对术后疼痛无效外,对其他疼痛均有效,作用缓慢且持久,目前还没有成瘾性的报道。

检测

近年来,随着渔业的发展,河豚鱼中毒事件的屡次出现,以及当前可能被恐怖分子利用的潜在威胁,使TTX的检测越来越为人们所重视,并具有重要的现实意义。现有的检测方法可分为生物测定法、理化分析法和免疫化学法、生物测定法、高效液相色谱紫外检测法（HPLC-UV）、高效液相色谱荧光检测法（HPLCFLD）、高效毛细管电泳法（HPCE）、液质联用、气质联用等方法。生物法有酶联免疫（ELISA）法和小鼠法等。

生物测定法

　　小鼠生物实验法、竞争置换法、组织培养生物实验法、动电位法。

理化分析法

　　荧光法、紫外分光光度法、薄层色谱法及其联用技术、电泳法及其联用技术、气相色谱法及其联用技术、高效液相色谱法及其联用技术。

免疫化学检测法

　　TTX的检测方法很多,每种方法都有其优缺点,可根据实验条件及要求选择恰当的检测方法。TTX作为钠离子通道阻断剂,虽然毒性强,但在临床中也可作为高效镇痛剂,并且对某些肿瘤有抑制作用,在神经生物学、药理学、肌肉生理学等方面被广泛用于工具药。随着TTX检测手段的不断完善, TTX的研究将会有更大的发展,在食品检验、中毒诊断、治疗及国家安全等方面发挥更大的作用。

ELISA法

　　ELISA法具有特异性好、灵敏度高,可定量检测,而且有采样量极小等特点，多用于河豚毒素的痕量检测；小鼠法是利用河豚毒素的毒性特点进行的小鼠毒性检测的方法，方法简便,但定量不准确且重复性差、目标性差，现已少用。

HPLCUV法

　　HPLCUV法是常用的检测手段，既可以检测含量，又可以作为有关物质的考察，河豚毒素没有紫外光谱特征吸收，采用末端吸收进行检测；国外多采用柱后衍生化荧光检测的方法进行含量测定，河豚毒素本身没有荧光，氢氧化钠破坏后产生降解产物C9碱具有荧光；荧光检测的灵敏度比紫外检测的灵敏度高，但在含量测定检测结果上两种方法不存在显著性差异。

HPCE法

　　HPCE法具有高分离度和高柱效的优点，但其有重现性差、灵敏度低、需要加入内标才能定量，在有更好的HPLC检测方法时，HPCE只能作为一个补充方法。具有高灵敏度与选择性的液质联用和气质联用在分析河豚毒素及其类似化合物时显示出了其特有的专属性和高分辨、高灵敏的优越性，也是近几年研究较多的方法，为河豚毒素杂质定性检测提供保障。

原因

科学家发现，河豚毒素是河豚鱼吃了含有河豚毒素的海洋藻类，并且通过自身的转化而存在于体内。本来是有毒的河豚，如果将它的幼苗弄到池塘进行人工饲养，它就能失去毒性。但是，如果给它喂食含有河豚毒素的饵料，它就会毒化，从而重新产生河豚毒素。河豚毒素的产生，除了与河豚饵料密切相关，还与河豚本身对毒素的接受机制有关。在同一海域，虽然大量生长着含有河豚毒素的海藻，但是有的河豚吃它，而有的河豚则不吃它，因此就出现含毒河豚与不含毒河豚的差异。 　　

海洋中含有TTX的细菌（即藻类），主要有弧菌属、假单胞菌属、发光菌属、邻单胞菌属、芽胞杆菌属、不动杆菌属等。放线菌主要是链霉菌属。这些含有河豚毒素的细菌，如果被具有接受机制的河豚或其它动物大量吞食，就会在体内形成强大的TTX毒力。 　　

对于具有TTX接受机制的河豚，若将TTX注射到它体内，它不会产生中毒现象，而对于其它鱼类是否这样，我们的试验仍在进行中。 　　

根据河豚毒素产生的原理，人们不必担心未来的TTX原料会枯竭。科学家已经试验成功，可以从含有TTX的细菌中直接提取TTX。到时候，人们可以采用生物工程技术大量繁殖这类含有TTX的细菌，从而能保证TTX提取的原料来源。

机理

河豚毒素是细胞膜钠离子通道选择性阻断剂。细胞膜钠离子通道的阻断，导致细胞膜去极化，从而特异性地干扰了神经一肌肉的传导过程。体外实验证明，河豚毒素对细胞膜上某些部位有非常强的亲和力，即使是非常稀的溶液（10–8M），细胞膜表面上每平方微米仅吸附几十分子，就可以完全暂时性中断钠离子流透入细胞膜，而钠离子流对神经一肌肉兴奋是必须的，然而稳定状态的钾离子流（它对静止状态的膜是重要的）则完全不受影响。有证据说明，河豚毒素的胍基对阻断钠离子通道起决定性作用。 　　

深入研究表明，河豚毒素对细胞膜的作用过程，并不是简单的“分子嵌塞作用”，而是通过毒素与膜上专一性受体结合。再通过关闭机制（gating mechanism）使通道关闭，河豚毒素作用于毒素受体（RTOX），可使h闸门（h—gate）关闭，阻滞钠离子通过细胞膜，使细胞膜失去极化状态，从而抑制甚至阻断了神经一肌肉的传导过程，导致神经肌肉活动障碍，严重者可发生麻痹状态。类似箭毒样作用，最后可引起呼吸中枢麻痹使呼吸停止，血管中枢麻痹，可引起血压下降，脉搏迟缓。最终因呼吸停止和循环衰竭而死亡。 　　

河豚毒素中毒主要表现为神经中枢和神经末梢的麻痹。一般先是感觉神经麻痹，继而运动神经麻痹，使肢体无力甚至不能运动。血管中枢麻痹引起血压下降，脉搏迟缓。呼吸中枢麻痹导致呼吸停止而死亡。此外，河豚毒素还可作用于胃肠道粘膜，引起急性胃肠炎症状。并能抑制去甲肾上腺素的释放。 　　

河豚毒素是神经细胞膜药物研究的标准工具药，临床上用于治疗各种神经肌肉痛、创伤及癌痛，肠胃及破伤风痉挛等。也用于局部麻醉药及神经性汉森（Hansen）型疾病等。

合成

TTX 独特复杂的结构和显著的生物活性吸引了大批有机化学家对其全合成的兴趣。1972 年日本名古屋大学的岸义人(现哈佛大学教授)首先报道了TTX 消旋体的全合成,随后的30年间虽然对其全合成的研究也有报道,但没有完成全合成的报道,TTX 一直被有机合成化学家认为是一个极富有挑战性和吸引力的,同时也是非常令人可畏的全合成目标。

　　近年来随着不对称合成有机化学的迅速发展,2003 年名古屋大学的矶部稔教授完成了对TTX 的不对称全合成,随后又有几个小组采用不同的合成路线完成了对TTX 的不对称全合成。不对称全合成均采用了逆合成的思路,合成策略。合成的难点是构筑季碳的不对称中心。 　　

随着新的不对称合成反应试剂和新的化学反应的发现,对TTX及其类似物的不对称全合成会有新的更为简洁的合成路线和方法。

展望

关于TTX及其类似物的化学结构研究已经成熟,但关于TTX 的结构修饰和构效关系的研究还未见报道。由于TTX 类化合物的毒性太强,限制了其临床应用,将来经过结构修饰或改造降低其毒性有可能扩大其临床应用。其药理作用和临床应用已有专门综述,但新的作用机制还在不断的被发现。 　

　河豚毒素虽为剧毒，但是其高活性和高特异性的生物特征有着潜在的、巨大的医药开发价值，在临床应用方面有广阔的前景，如果利用妥当，“变毒为宝”，既减少河豚毒素处理不当对环境造成的污染，又可以创造经济利润。从稀有昂贵的河豚鱼卵巢、肝脏等内脏器官中提取河豚毒素，技术要求精湛，寻找到先进、合理的提取工艺，可以申请专利，形成技术壁垒，具有很高的商业开发价值。 　　

河豚毒素的临床应用研究显示，河豚毒素可以用作消炎镇痛药物、还有局麻、治疗肌肉痉挛的功效，河豚毒素既可以治疗心血管疾病，又可以作为毒品的戒断药物。日本有河豚毒素针剂，国外其它国家尚未有以河豚毒素为主药成分的药物研究，国内已有多个厂家正在申报河豚毒素的原料药及其制剂，现已通过审评进入临床阶段，充分肯定了河豚毒素开发的可观前景。

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