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玩转质粒系列二:过表达基因序列获取与重组质粒构建

2018-05-06  yjt2004us



首先,根据目的基因CDS序列的长短,可以通过两种方法获取目的基因序列:

1)设计CDS引物,通过提取组织RNA,并设计相应引物,运用PCR的方法获得目的基因CDS序列,连接到克隆载体后,挑取单克隆进行测序。这种方法相对成本较低,但是PCR过程可能引入突变。适合基因CDS序列较短的情况。

2)全基因合成:根据目的基因的CDS序列,直接交给公司设计合成目的基因。此方法优点准确性高,相对成本会高一些,需要专业的合成公司完成。适合基因CDS序列较长或者人工改造的任何基因序列。有些公司会将目的CDS序列连接至克隆质粒载体上,此时我们可以通过两种方法获得:A:CDS两端限制性内切酶进行酶切,将酶切后片段通过胶回收方式连接至载体。B:设计引物将CDS区通过PCR方法获取,注意如果序列较长,最好使用高保真酶,防止PCR过程中碱基突变。


下面以人类基因为例,介绍下第一种方法中目的基因的获取。

1目的基因的CDS序列获取

1.进入NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)

2.选择ROR1基因,种属来源,如人类。

3.点击ROR1基因进入,下拉网页找到mRNA,在这里我们随机选择第二个转录本,点击NM_001083592.1,获得基因序列的CDS区。

4.获取目的基因序列。

2目的基因的CDS序列引物设计

基因过表达,既需要将基因的CDS序列完整序列克隆至表达载体。

1)获得CDS序列后,通过DNAuser软件分析一下目的基因的酶切位点。打开DNAuser软件后,将CDS序列复制粘贴至对话框,点击限制性内切酶图谱进行位点分析。

2CDS的获取

通过Trizol法提取野生型组织或细胞RNA,步骤简单概括为:加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--离心--加入氯丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心--溶解。

得到RNA后进行逆转录,得到目的基因的CDNA

3)根据目的质粒上限制性酶切位点的情况,设计对应的引物,以CDNA为模板,进行PCR,得到包含酶切位点的全长CDS序列。

A:连接法引物设计。
上游引物设计:

5‘-保护序列+限制型酶切位点+CDS起始后20个碱基

下游引物设计:

5‘-保护序列+限制型酶切位点+CDS结束前20个碱基的反补序列

双酶切时,需要在酶切位点前面加上保护碱基,以保证最佳的酶切效率。选取酶切效率最高的保护碱基。

B:重组法引物设计:

上游引物设计:

5‘-载体序列20个碱基+限制型酶切位点+CDS起始后20个碱基

下游引物设计:

5‘-载体序列20个碱基+限制型酶切位点+CDS结束前20个碱基的反补序列

4PCR扩增CDS序列

由于基因CDS序列一般较长,1kb-3kb之间可以通过PCR的方法,序列过长最好选用专门的试剂盒或者交给公司。即便如此,在扩增过程中,一定要选择高保真酶,防止引入突变。

PCR的程序可以选择两步法,也可以选择三步法,重点在延伸阶段,可以根据1kb/30s进行设定,循环数最好设置为35-40

A:两步法

Temp

Time

cycle

95

5min


95

30s

35-40cycle

68

1:30s

4

hold


B:三步法

Temp

Time

cycle

95

5min


95

30s

35-40cycle

60

30s

68

1:30s

4

hold


5CDS序列与质粒载体连接。

  A:连接法:T4连接酶

线性化载体

25ng-50ng

CDS扩增PCR胶回收产物

2ul

10xT4  buffer

1ul

T4  DNA ligase

1ul

ddH2O

补至10ul

目前T4连接酶大多是快速连接酶,可以选择16度进行10-30分钟,或者选择4度连接过夜。

  B:重组法:重组酶

线性化载体

50ng

CDS扩增PCR胶回收产物

20200  ng

Exnase®  II

2  μl

5×CE  II Buffer

4ul

ddH2O

补至20ul

37度水浴30min后置于冰水浴中冷却5 min即可。

6)将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a,涂板,培养过夜后,挑取单克隆菌落进行测序,验证序列正确性。

7)细胞转染过表达质粒,进行验证过表达效率。

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