如何把circRNA的上游机制做细？

要确定研究的分子，可以自己做测序，也可以查文献、做生信预测（师兄在讲座中常讲的）。这篇文章采用的策略是，首先做测序，挑上调前8，下调前8的进行PCR验证，最终他们挑选了在肝癌中下调的cSMARCA5作为进一步研究对象，原因有：

1、在肝癌和正常肝组织中cSMARCA5的基因丰度高；

2、cSMARCA5的表达趋势与它对应的mRNA和蛋白相反，预示着其潜在的生物学功能；

3、在2015年的一篇Cell的文章中报道(The RNA Binding Protein Quaking Regulates Formation of circRNAs)，cSMARCA5在上皮间质转化（EMT）的过程中起到了重要的作用。

circRNA挑好了，但你挑的真的是circRNA么？所以先要验证cSMARCA5确实是一条circRNA。为此作者做了以下验证工作：

1、cSMARCA5没有poly(A)尾巴；

Fig 2C. 在加入Oligo(dT)18引物（Oligo(dT) Primer利用了碱基互补配对的原则以及mRNA含有poly(A)尾巴的特点，使得Oligo(dT)Primer只能和mRNA配对，并在适宜的条件下完成反转录。）之后，cSMARCA5表达显著下调，而mSMARCA5无显著变化。

2、cSMARCA5对RNase R的有耐受性

Fig 2D.cSMARCA5对RNase R的耐受性远高于mRNA

3、cSMARCA5的半衰期比mRNA的长

Fig 2E.cSMARCA5的半衰期远比mRNA的长

之前说到，cSMARCA5的表达趋势与mSMARCA5以及蛋白是相反的，为什么呢？

circRNA和mRNA均来自于pre-mRNA，转录后修饰在RNA前体加工为成熟RNA的过程中起到了重要的作用。其中，RNA结合蛋白对于circRNA的产生具有重要的调控作用。根据文献报道，DHX9、ADAR1和QKI这三个RNA结合蛋白的作用最为普遍，在敲减DHX9后，cSMARCA5的表达量显著上调（其它两个没有显著作用）。

Fig 3D.敲减DHX9后，cSMARCA5的表达量显著上调，mRNA和pre-mRNA无显著变化。

DHX9是RNA核解旋酶，它可以通过结合circRNA侧翼的反向互补序列并抑制这些序列的配对来抑制circRNA的产生。对结合序列进行突变可以逆转DHX9对cSMARCA5的抑制作用。

至此，cSMARCA5的上游机制研究基本结束。下游机制则是我们非常熟悉的ceRNA机制了，cSMARCA5通过吸附miR-17-3p和miR-181b-5p调控TIMP3（广泛报道的肿瘤抑制分子），由于肝癌中cSMARCA5下调，相应的miRNA上调，导致TIMP3下调，从而促进HCC增殖和侵袭。

分子机制图

当然了，一篇12分的文章，动物实验肯定是少不了的，这里也不再赘述了。

circRNA的上游机制总结下来可以从这两方面着手：

1、circRNA的产生机制；

2、影响circRNA差异表达的原因（可变剪切、转录后修饰）。