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荧光成像作为一种直观、原位的可视化观测技术在功能分子标记和检测方面得到了广泛的应用。其中，以有机荧光染料为基础的生物分子标记和分子荧光探针具有操作简便、重现性好等优点，可方便用于生物分子的原位、实时无损伤检测以及生物分子及其生物过程的追踪。然而，大多数荧光染料（如荧光素，罗丹明，恶嗪和花菁素）的Stokes位移都非常小（一般<30 nm），导致激发光谱和发射光谱之间的严重串扰，造成成像时信噪比低和严重的荧光自淬灭现象，限制了其在生物成像中的应用。 通过理性设计和理论计算，袁林教授课题组提出一种增大常规荧光染料Stokes位移的通用策略——Alternating Vibronic Structures，并用这种策略合成了系列荧光染料（罗丹明类、恶嗪类、方菁酸类和花菁素类等）。与母体染料结构相比，这些染料的Stokes位移、光稳定性和成像亮度等都得到显著改善，并且染料的吸收和发射波长也显著红移（JACS-图1）。
JACS-图1. a）荧光显微镜光路显示分色镜过滤器信号；b）通过引入不对称电子结构增加了染料Stokes位移 （来源：J. Am. Chem. Soc.） 首先，团队通过理论计算发现常见的小Stokes位移染料如O-派若宁（OP），Si-派若宁（SiP）以及恶嗪（OX）都表现出完全对称的HOMO轨道和LUMO轨道（JACS-图2，上）。这一特征使得染料分子具有较高的荧光量子产率和非常小的Stokes位移（OP：16 nm，SiP：14 nm，OX：23 nm）。然而，当团队将这些染料分子的一个二烷胺基替换成1,4-二烷基十氢喹喔啉（DQ）后，计算得到的Stokes位移显著增大（DQ-OP：113 nm，DQ-SiP：196 nm，DQ-OX：154 nm）。重构后的染料电子结构显示，LUMO仍然保持对称，但HOMO显示出清晰的不对称振动特征，并且DQ结构的引入有效地增加了初始对称结构上的HOMO能级。因此，处于激发态的电子可以返回到更高能量的振动状态，使重构后的染料（DQ-OP，DQ-SiP，DQ-OX）发射波长红移并具有大的Stokes位移（JACS-图2，下）。
JACS-图2. DFT理论计算（激发态前线轨道及其相应的理论吸收/发射波长） （来源：J. Am. Chem. Soc. ） 为了证实计算结果，团队合成出了DQ稠合染料DQ-594、DQ-707和DQ-683，并比较了这些染料在同种溶剂中的光物理性质。如JACS-图3所示，所有的母体染料都表现出很小的Stokes位移（OP：19 nm，SiP：12 nm，OX：14 nm），而修饰过后的DQ衍生物表现出非常大的Stokes位移（DQF-591：58 nm，DQF-707：122 nm，DQF-683：81 nm）。此外，相比于母体染料，修饰后的DQF染料的吸收/发射波长也发生明显的红移。这些实验结果与理论计算非常吻合，表明通过增强不对称振动确实可以有效地增大荧光染料的Stokes位移。
JACS-图3. 新型DQF染料DQF-594、DQF-707、DQF-683与其母体染料OP、SiP、OX在乙醇或二氯甲烷溶液中归一化的吸收与发射光谱 （来源：J. Am. Chem. Soc.） 为了验证这种策略是否是一种改善荧光染料Stokes位移的普适性方法，作者进一步在罗丹明、罗丹荧、方酸菁和花菁素等染料结构中引入1,4-二烷基十氢喹喔啉（DQ）。如JACS-图4所示，经过不同手段修饰DQ基团后，相比于其母体染料，新构建的荧光染料DQF-570、DQF-560、DQF-680和DQF-692的Stokes位移都显著提升，同时伴随着极为明显的吸收和发射波长的红移。这些结果进一步证明通过增强不对称振动确实可以有效地增大荧光染料的Stokes位移。
JACS-图4. 其他分子骨架DQF染料（DQF-570、DQF-560、DQF-680、DQF-692）与其母体染料（罗丹明6G、罗丹荧、方酸菁、花菁素）在乙醇溶液中的归一化吸收和发射光谱 （来源：J. Am. Chem. Soc.） 细胞中的光稳定性实验表明，相比于其母体染料，DQF染料具有更好的光稳定性，非常适合用于长时间细胞或活体成像。尤其适用于对荧光染料光稳定性要求很高的单分子和超分辨成像应用。
JACS-图5. 染料DQF-570及其母体染料罗丹明6G（Rh6G）的光稳定性 （来源：J. Am. Chem. Soc.） 在以上测试结果的基础下，团队进一步考察了新型DQF染料在其他成像方面的应用。首先，利用DQF染料大Stokes位移这一特点，团队将其与母体染料连用，成功实现了线粒体和溶酶体的单激发和双发射同时成像分析（JACS-图6a）。其次，由于DQF染料具有高摩尔吸光系数，大Stokes位移以及红移的吸收/发射波长，团队将其用于小动物活体成像效果评估。JACS-图6b显示，在三种不同波长光激发下（675, 710, 745 nm），收集ICG通道（810-875 nm）荧光，DQF-692的发射强度都显著强于商业化染料ICG。这表明DQ修饰染料可以提供大Stokes位移的近红外发射，适合活体动物成像。
JACS-图6. DQF染料在多色成像（a）及小动物成像（b）中的应用 （来源：J. Am. Chem. Soc.） 该研究成果以 “A General Method to Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures”为题发表于国际顶尖化学期刊《美国化学会志》（J. Am. Chem. Soc., 2018, DOI: 10.1021/jacs.8b04404）。论文的通讯作者为湖南大学化学化工学院袁林教授，研究工作主要由化学化工学院的任天兵、许望、张维、王志尧、向振等同学共同完成，并得到了张晓兵教授的大力支持，以及国家自然科学基金优秀青年基金和湖湘青年英才等项目的支持。 原文节选自https://www./zixun/22592 看更多新鲜资讯，搜ChemBeanGo！ |
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