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睡眠现象从无脊椎动物到哺乳动物中广泛存在，但其分子机制仍是现代生物学界一个巨大的未解之谜。近日（6月14日），日本筑波大学国际综合睡眠医学研究所刘清华课题组等科学家，在国际著名期刊Nature上发表了睡眠调控机制研究领域的重要突破。研究者运用蛋白组学与磷酸化组学的研究方法，从“磷酸化/去磷酸化循环调控”角度提出了睡眠分子调控的新理论，研究揭示SNIPP磷酸化是睡眠需求的分子标记，SNIPP的磷酸化-去磷酸化循环是睡眠-觉醒稳态与突触平衡的主要调节机制。 1、蛋白质组学、修饰组学分析样本差异 图1 技术路线 为了研究“睡眠需求物质”是否是某种未知的蛋白质？研究人员首先通过蛋白质组学方法，对三种不同处理的小鼠的全脑组织蛋白质组进行分析：睡眠6小时，睡眠剥夺6小时和剥夺6小时睡眠后补充睡眠3小时。研究结果显示，不同样本间在蛋白表达水平上，并没有发现有意义的变化。 蛋白质本身表达水平未变，并不意味着其它方面未受调控。在生物学上蛋白质的功能除转录水平的调控外，还包含众多蛋白质翻译后修饰（PTM）的调控。磷酸化修饰是蛋白质修饰调控中最常见的一个，参与几乎所有的生物过程。除了作为信号转导的核心机制，还参与线粒体功能、细胞骨架调控、细胞膜蛋白功能、转录调控等生物过程，在生命科学各领域的研究均有涉及。之前也有科学家揭示磷酸化修饰在代谢稳态与生物节律中发挥关键性的调节作用（详情请见：核蛋白组及磷酸化组学绘制哺乳动物昼夜节律调控全景图）。 研究人员继续采用高通量磷酸化蛋白质组学方法对Sleepy小鼠和经典的睡眠剥夺小鼠模型的磷酸化水平进行分析。研究结果表明，睡眠剥夺6小时组的蛋白磷酸化程度显著高于其它两组，说明睡眠剥夺使大脑增加的极有可能就是蛋白磷酸化的程度。Sleepy小鼠的研究也得出了同样的结论：蛋白质含量不变，但Sleepy小鼠中许多蛋白质的磷酸化程度显著增高。两者间存在大量相同的磷酸化程度升高的蛋白质，结果证明：磷酸化修饰在睡眠需求中发挥关键性的调节作用。 图2 小鼠脑组织样本中存在大量磷酸化程度升高的蛋白质 2、修饰组学分析，筛选控制睡眠内稳态的重要分子标记 为了从差异蛋白中筛选到控制睡眠内稳态的重要分子标记，也既是“睡眠需求物质”，接下来，研究者对这些存在差异的磷酸化蛋白进行分析。并从中筛选得到80个整体上磷酸化程度变化最大超磷酸化蛋白，将之命名为SNIPPs蛋白（Sleep-Need-Index-PhosphoProteins）。其中69个可归类于神经突触蛋白，而且其中12个蛋白已报道证明其可能导致小鼠或人类睡眠的异常。结果表明：这些SNIPPs整体或大部分可能是睡眠需求的分子基础。 3、分析SNIPPs蛋白的磷酸化程度介导睡眠需求的分子机制 为了研究SNIPPs蛋白的磷酸化程度介导睡眠需求的分子机制，研究者对小鼠脑组织蛋白质磷酸化在不同时期的变化展开分析。 研究发现SNIPPs蛋白的磷酸化水平随着睡眠剥夺时间的增加而逐渐积累。说明了脑内蛋白磷酸化水平，尤其是SNIPPs蛋白的磷酸化水平的逐渐积累，与睡眠需求的积累是正相关的。Sleepy小鼠模型实验也证实了这一点：小鼠通过磷酸化结合蛋白提高SNIPPs蛋白的磷酸化水平，从而使大脑产生强烈的睡眠需求。
图3 磷酸化/去磷酸化循环调控模型 4、动物实验验证，磷酸化/去磷酸化循环调控模型 最后，研究人员使用特异性抑制剂HG-9-91-01抑制小鼠的Sik3 蛋白激酶活性，对分子机制进行验证。研究发现在脑室注射HG-9-91-01后， SNIPPs蛋白磷酸化水平也有所降低，同时显著降低了小鼠睡眠需求（慢波强度）。这些结果都说明SNIPPs的磷酸化程度在睡眠内稳态调控中起到重要作用。 当常规的蛋白质组学研究发现样本间不存在有意义的差异变化后，研究者从从“磷酸化/去磷酸化循环调控”角度提出了睡眠分子调控的新理论。研究发现清醒状态下，SNIPPs 蛋白的磷酸化水平特异性的升高，其磷酸化的程度决定了清醒过程持续的时间和清醒程度；SNIPPs蛋白磷酸化水平的变化伴随着其蛋白质功能上的改变和睡眠需求的积累，从而决定了后续睡眠的质量和持续时间。睡眠将促使SNIPPs蛋白去磷酸化，同时起着修复大脑损伤、参与记忆的形成和巩固过程。 “磷酸化/去磷酸化循环调控”这一睡眠内稳态机制为维持睡眠和清醒系统的平衡，并防止由于SNIPPs等重要神经突触蛋白的过度磷酸化而造成大脑的系统性损伤提供了重要的保障机制。研究为睡眠研究的未来走向提供了崭新的视角，也为神经突触稳态及睡眠稳态机制研究提供了重要的引导作用。 值得一提的是，生命科学的研究将不仅仅停留在基因组学或常规蛋白质组学层面，除了文中所提到的磷酸化修饰，其他如泛素化修饰、巴豆酰化修饰等蛋白质翻译后修饰，同样在包括昼夜节律、肿瘤转导等各个生命活动中发挥着重要的调控作用。如泛素化修饰与节律：泛素化修饰与昼夜节律调控机制；二羟基异丁酰化与糖酵解：Mol. Cell：P300作为二羟基异丁酰转移酶调控糖酵解途径。在科学研究中灵活选择蛋白质翻译后修饰，势必为生命科学的研究，如表观遗传学、分子机制、生物标志物发现、临床检测等带来新的启发与可能。 修饰类型 磷酸化、乙酰化、泛素化、单甲基化、二甲基化、三甲基化、N-糖基化、O-糖基化、巴豆酰化、琥珀酰化、丙酰化、丁酰化、丙二酰化、戊二酰化 研究内容 ● 蛋白质修饰位点鉴定 ● 高通量蛋白质修饰谱分析 ● 定量蛋白质修饰谱分析 iTRAQ/TMT修饰定量 SILAC修饰定量 Label-free修饰定量 同位素二甲基标记修饰定量 |
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