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bigSCale: an analytical framework for big-scale single-cell data 2018.5.3 西班牙研究人员在Genome Research上发表了一个用于对单细胞进行大规模分析的工具-bigSCale，该工具包括对成千上万的细胞进行降维，聚类，差异分析，鉴定每个细胞群体的特异表达基因等。随着单细胞测序技术的火热，现在产生了越来越多的单细胞测序数据，比如各种人类细胞图谱计划等，bigSCale的产生使得研究人员不再惧怕大型数据分析带来的各种挑战。 下面我们来看一下整个文章的分析结果： bigSCale的分析框架 scRNA-seq数据在基因表达谱中会呈现出很多噪音，包括扩增偏差，测序深度差异等，bigSCale因此建立了一个概率模型，用来定义细胞间的表型距离。 1,为了产生这个模型，转录组表达高度相似的细胞被归为一组，这一过程也叫做preclustering，这样分出的每个group中的细胞被认为是生物学重复，后续用来评估技术噪音。在进行preclustering的时候需要先对表达谱进行标准化处理，包括（1）将reads或者UMI按照library size进行标准化，（2）对标准化的表达值进行log转化，（3）将每个基因的表达值进一步标准化到相同的间隔，（4）计算细胞间的皮尔逊相关系数，利用ward's linkage进行层次聚类，确保高度相似的细胞被聚到一个group。然后组内表达差异被用来估计噪音，bigSCale会给每个基因一个P值，代表细胞与细胞间表达变化的可能性。 2，差异基因分析时，bigSCale会给每个基因一个P值，表示两组细胞表达变化的可能性。bigSCale会对进行比较的两组细胞进行所有细胞对的比较，在任意两个细胞进行比较过程中，重复出现的差异基因会进行累计得分，这些得分最后矫正成P值。 3，进行细胞聚类时，计算所有细胞对的距离，产生一个距离矩阵，进而把细胞归到不同组。在进行聚类计算的时候bigSCale选取的是那些变异度大的基因，一些相关系高的基因，孤立的基因，或者与性别相关，与细胞周期相关的基因都被剔除。 4，鉴定出cell cluster之后，下一步就是进行迭代的差异分析，寻找能代表每一个cell cluster的基因marker 5，bigSCale具有极高的处理速度，能够直接分析高达100000个细胞的数据。 鉴定差异表达基因 为了评估bigSCale在寻找差异基因方面的表现，研究人员对1920个来源于四个综合征患者（WB,Dup7，注：这些患者在chr7特定区域有连续多个基因发生缺失或者扩增，这些基因是否能检出可以用来评估算法敏感性）的细胞和735个来源于健康捐赠者的细胞利用不同算法（bigSCale, monocle2, BPSC, SCDE等）进行差异分析。对WB1患者进行分析，分析结果显示bigSCale对12个下调基因的检出具有最高敏感性（图A），同时它检出的基因数也最多（图B）。在对剩下三个患者的分析中，bigSCale依然表现很佳（图C），在差异基因分析方面优于其他方法。之后研究人员又通过分析simulated data sets（包括不同数据量间的比较等）来比较bigSCale和其他工具在寻找差异基因方面的表现，同样bigSCale在敏感性和特异性方面要优于其他工具（图E, F）。而且在分析速度等方面也要优于其他工具（图H, I）。
细胞聚类和亚群maker鉴定 为了评估bigSCale在细胞类型，亚群鉴定中的表现，研究人员分析了Zeisel在2015年发表的文章中用到的3005个来自大鼠躯体感觉皮质和海马体的细胞，跟Zeisel研究结果一致，bigSCale能够分出所有主要的脑细胞类型，即躯体感觉锥体神经元，不同类型的CA1/2椎体神经元，中间神经元，星形胶质细胞等（图A）。在分析脑细胞群间差异表达基因时，bigSCale分析出来的差异基因是Zeisel用BackSPIN分析出来的差异基因的四五倍，而且bigSCale分析得到的每个细胞亚群的基因标志物更为特异（图B）。
将大的数据集卷积成iCells 为了分析成千上万的细胞，bigSCale根据利用模型处理过的表达谱将单个细胞卷积成iCells。为了确保卷积策略不会影响细胞表型，研究人员通过分析20000个脑细胞来评估bigSCale的表现。研究人员将这些细胞进行不同程度的卷积（4587-2102 iCells），比较卷积前后细胞亚群分类的变化。这里研究人员是利用Rand index（RI）来衡量分类相似性（RI=100%表明分类完全一样），他们观察到卷积前后细胞分类具有很高相似性（RI>80%）（图A），当增加cluseter数量或者卷积程度，RI指数都区域平稳，表明bigSCale在降低细胞数的过程中具有鲁棒性。
分析1306127个大脑皮层细胞 这是目前为止最大的scRNA-seq数据集，庞大的数据量阻碍了详细的数据分析。研究人员认为他们的bigSCale非常适合分析此类数据，可以对细胞类型细胞状态等进行深入分析。 首先研究人员利用他们的卷积策略将数据大小从1306127个细胞降低五十倍，变成26185个iCells。对这些iCells聚类生成16个cell populations（图AB），找到16242个差异表达的markers，再将这16个populations分成4个主要的细胞类型：非神经元的(1-4)，神经祖细胞（5-8），胶质细胞（9-11）和有丝分裂后期神经元（12-16）。之后研究人员就将他们找到的细胞类型和marker去跟别人研究结果进行比较，印证bigSCale分析的可靠性。总之就是分析结果很可信~~~
对高分辨率亚群进行去卷积分析 bigSCale能将一百多万个细胞缩小成几个主要的细胞群体进行分析，同样也可以对一个感兴趣细胞群体中的单个细胞进行分析。在这一部分分析中，研究人员选取的细胞群体为Cajal-Retzius (CR) neurons。到目前为止，人们对CR细胞的表型特征，潜在的亚群分类等仍然不太清楚。为了揭示CR细胞的多样性，研究人员将480个Reln-positive的iCells去卷积成17543个Reln-positive的细胞。对这些细胞进行层次聚类，可以分出8个亚群（图A），对这些亚群进行分析，研究人员认为bigSCale的分析揭示了CR细胞潜在的不同分化阶段（不同分化阶段对应不同的基因表达）。 总之，根据文章介绍，bigSCale就是一个单细胞测序数据分析的神器，既能找差异又能分细胞亚群，傻瓜式操作走起来~~~ 附软件链接：https://github.com/iaconogi/bigSCale |
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