  以下内容将重点讨论TMB 在肿瘤临床中的应用，包括目前仍然存在的需要警惕的不足（Caveats），为了将这项基于高通量测序技术的精准免疫决策流程应用于肿瘤免疫实践，仍然需要不断努力的方向。 Timothy A Chan  在我的理解中（Timothy A Chan）免疫是系统的肿瘤治疗战术，它所引起的肿瘤应答的方式，有效性和耐药的方式都大大有别于我们过去所熟悉的治疗策略。 有别于过去5-10年，我们用基因组学的方法(单靶点或高通量测序）来确定癌细胞中的1-2个致命的突变并且锚定特殊的靶点（Achilles Heels）来治疗肿瘤，但是免疫治疗则采用了截然不同的方式，需要我们充分动员 机体适应性免疫 和天然免疫(adaptive and innate )的功能. 复杂问题简单化，我们把T细胞当做整个适应性免疫的核心。 免疫系统进化出辨别自我和非我的能力（self vs non-self）这就是我们所需求的治疗窗（therapeutic window）,自我与非我的差异程度，它不是一个单一的突变。免疫系统不关心某个名叫p53，p10，BRAF，ras基因的异常。 但实际上，这些都是基于结构和序列的标识符。 如果这组标识符识别出某些东西为“外来物”，例如细菌或病毒，或者在某些情况下识别癌症，那么免疫系统可以重新参与攻击这些肿瘤细胞。 而且肿瘤部分是”非我“的”，所以这是许多不同类型的免疫治疗如免疫检查点阻断能够起作用的基础。 更重要的是，与针对特定突变的小分子不同，免疫系统确实具有持久性和记忆力的。 这也影响了整个社区对疗效标准的判断。  肿瘤免疫治疗的实践的确带来了令人印象深刻的临床疗效，在一部分晚期病人中，我们看到了令人惊喜的持久的疗效。但是当我们关注到，没有肿瘤应答的患者的比例，我们会知道，还有很长的路需要探索，有有效应答的人群尚不到50%, 更重要和显而易见的是，我们能看到最近很多的阴性的临床结果， MYSTIC，IMvigor211 ，还有最近的IDO   对于免疫治疗生物标志物的认识在不断的进化当中，我们知道了 突变负荷（mutation burden），PD-L1表达（免疫组化染色和定量），新抗原负荷（neoantigen burden）,以及一些已知的具有免疫原性的驱动突变或耐药突变。我们听到了形形色色的有关于biomarker的演讲，甚至还包括微生物对肿瘤微环境的影响，免疫系统的复杂程度远远超过我们所能认识到的。接下来我们将集中讨论 基因组学在其中将扮演什么样的角色，我们如何应用NGS 检测平台，并且对免疫治疗产生影响。  DNA或基因组决定表型，那么通过对DNA的观察鉴定能够发现参与决定某种免疫表型的机制，这是现代molecular biology 的基础。这是许多假设的基础。基于这个假设，我们来看看TMB是怎么回事。  早期的报道TMB与疗效相关性的数据罗列如下： 这是发表于数年前的Keynote001的拘束，初始治疗失败的NSCLC接受pembrolizumab进行治疗。检测的assay为WGS(whole genome sequence),检测的方法很简单，就是对整个基因组或者外显子组中错义突变的数量进行计数。从左图中可以看到，当我们以6个月的持续应答为评价指标，能够将2群病人比较明显的区分开，疾病有效的患者往往TMB较高。当我们用新抗原负荷进行评价时，观察到的现象也一致。  在这里我们看到高突变负荷的病人从Ipilimumab中获得了非常持久的疗效，durability,有些患者疾病控制长达数年。  肿瘤突变负荷确实是替代标志符，代表了由突变产生的免疫原性肽的数量。 这些由体细胞突变产生的肽经过后续处理，被放到MHC class 1和2细胞上，它们部分影响肿瘤微环境的组成。这就是免疫系统（T细胞）会攻击的对象。也就是免疫检查点抑制剂（checkpoint inhibitor CPI）将T细胞“再次动员”后，T细胞攻击的对象。  进一步研究下这个假设，我们能从这张复杂的幻灯中看到有趣的“信号”，这是34例KEYNOTE001的患者分析。Y轴的高度代表了总的突变负荷的数量，绿色的柱子代表有response的患者，红色则代表没有response。我们可以显而易见的看到，那些有response的患者往往具有更多的DNA损伤修复突变。所以高肿瘤突变负荷是从哪里来的？在图中我们可以看到POLE 突变，POLD突变，BRCA突变，MSH-2突变，后续启动了多项针对这些突变的临床研究。 在随后的文章中，我们看到MSI（微卫星不稳定）阳性的患者（无论何种肿瘤类型）都对CPI 表现出较好的应答，而MSI+则是一种突出的高肿瘤突变负荷的状态。从右图看到，MSI-H病人肿瘤标志物下降明显（蓝线），waterfall plot看到明显的肿瘤缩小（蓝）。 BMS进行了相似的研究，在CM142中同样看到MSI-阳性患者表现出良好的肿瘤应答。 从这张时间表上可以看出，许许多多的试验重复了这一发现，atezolizumab,nivolumab,pembrolizumab 在不同的临床研究中均显示 疗效于高TMB存在的相关性。最近的一项3期临床研究报道是Checkmate227，cutoff 是10. 更加值得关注的是，在可切除的NSCLC中，高TMB与更好的Nivolumab单药新辅助治疗肿瘤应答相关。 并且在CM026中，用WES检测出的高TMB能够提示nivolumab单药较化疗延长PFS HR0.62. Patients in the low, medium, and high TMB tertiles had 0-99, 100-242, and ≥243mutations, respectively. 同样，在2018年公布的TMB与Atezolizumab在不同肿瘤中疗效相关性的分析提示，用FMI的Foundation one panel进行检测，TMB大于16与Atezo 单药更好的疗效相关（mUC ，NSCLC） 对于MSI-H阳性的患者，FDA已经通过快速审批，批准CPI(pembrolizumab,Nivolumab ）跨瘤种的适应症。 大量的临床研究正在寻找其他高TMB的可能解释，显而易见，POLE POLD突变是最好的low hanging fruit. 随着NGS panel的获批（FMI-F1，mskcc-impact，还有很多追随者），TMB检测也慢慢走近临床实践。 来自Flatiron 和Foundation发表的2000例NSCLC病人的回顾分析数据提示，即便在community 医院，在all comer人群中（不看PD-L1表达状态）高TMB分位仍然能够提示更持久的临床获益。 关于检测的panel，基本上，需要大于300,400,500 的panel能够获得比较精确的TMB的信息。 有一种方法是，我们可以看突变的质量，如果把特定数量突变的克隆性clonality纳入考量的话，能够明显看到不同于单纯突变数量的价值。如果肿瘤携带有更多数量的克隆性突变（克隆性新抗原），则会产生更好的肿瘤应答。从概念上，这很好理解，如果肿瘤更“单纯”或者新抗原仅有一种克隆特征，就更容易被T细胞追杀到。如果肿瘤产生了许许多多不同克隆的突变，那么T细胞需要能够识别不同的克隆，这会为达到最大的肿瘤缓解造成障碍。 另一个我们需要重点关注的领域是germline diversity.在过去，已经非常确定的是，患者的Class I/II等位基因的基因型在抵抗感染性疾病方面的重要预后意义。因此选择HLA多样性是进化选择。 而且很多来自于T细胞抗肿瘤能力的多样性不仅来自肽的多样性，还来自种系中的同源MHC。 意味着，更高的HLA diversity往往意味着更好的临床获益 我想也许我们看到的很多信号都在这张幻灯片中，这并不意外。真正发挥作用的是我们一直在谈论的foreignness，可能来自与紫外线或者烟草暴露 PD-L1表达和TMB似乎正视图告诉我们不一样的东西，如何将这两者进行整合是值得探究的方向。 bTMB也是正逐渐被关注的方向。在POPLAR OAK的回顾性分析中发现，ctDNA中检测TMB≥16能够提示Atezolizumab更好的疗效。 今年ASCO 公布的一项II期前瞻性单臂临床研究提示，bTMB≥能够区分出Atezolizumab获益更大的人群。 |
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