干货|干细胞培养的进展和挑战

摘要

干细胞(SCs)在细胞治疗、组织工程学和再生医学以及药物和生物技术应用上有着巨大的前景。干细胞具有自我更新的能力，并且可分化为特定的细胞类型（取决于干细胞的分离来源）。然而，干细胞应用在临床上需要用到高质量和高数量的干细胞，这就需要干细胞的大规模扩大，然后有效且均匀的分化为功能性衍生物。传统的细胞维持和扩张依赖于利用塑料培养板和异种培养基的二维(2-D)培养技术，这种方法下，细胞扩大程度有限，且长期传代后，细胞往往失去克隆和分化能力。最近，干细胞扩增的新方法强调三维（3-D）细胞生长以模仿体内环境。本文献对近期使用二维和三维技术培养干细胞所涉及的球体、生物材料和生物反应器的最新进展提供了一个综合性的概要。此外，还讨论了实现细胞数十亿倍增长面临的潜在挑战。 

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引言

干细胞具有自我更新和分化为特定细胞的能力，并由其来源和分化程度来定义干细胞类型。多能干细胞能够无限制的自我更新和分化为体内200多种细胞中的任何一种。多能干细胞总共有两个来源。首先，胚胎干细胞(ESCs)是由着床前囊胚内细胞团衍化而来，其多能性由包括核心转录因子、八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区域Y-方框2(SOX 2)和抑制性突变体同源框(NANOG)的内在调控网络调控。第二，诱导的多能干细胞(IPSCs)是通过异位或升高表达对于诱导体细胞多能性必不可少的4种转录因子而获得的：OCT4，SOX2，Kruppel样因子4(KLF4)，和MYC原癌基因(C-MYC)。

另一种类型的干细胞，间充质干细胞(MSCs)是从成人中如骨髓和脂肪组织或围产期组织，例如脐带、脐带血、胎盘和羊水等来源中分离出来的。MSCs以在塑料培养板上贴壁生长为特征，表现出克隆性生长。它们对间充质细胞表面标记物、CD 90、CD 73、CD 29和CD105表现阳性，对造血系标记物、CD 45、CD 34和HLA-DR表现阴性。与多能干细胞不同，间充质干细胞是多向潜能的，只分化为有限的细胞类型，如成骨、软骨和脂肪细胞。此外，其自我更新和分化潜力取决于其分离来源。此外，来自成人组织的间充质干细胞也会受到老化和可能改变遗传稳定性的环境压力的影响。与成人MSCs相比，从围产期组织中获得的MSCs具有更高的生长和干细胞生长潜力。

因此，对干细胞的研究有助于阐明基本的生化和发育过程。他们也在体外疾病模型，组织工程学，再生医学和细胞治疗，以及药物应用方面显示出巨大的潜力。并且，干细胞还可用于药物的发现和开发。所有这些用途都需要高质量细胞的大规模生产。

传统上，干细胞在二维(2-D)塑料培养板中以单层的形式扩增，常常需要未知或异种材料，包括但不限于附着基体，细胞因子和生长因子，以及血清。使用异源或动物源培养基可以潜在地传播病原体，并且由于所用材料批次差异，其培养重复性受限。

单层培养需要通过常规传代来保持细胞的自我更新和潜能，这对于细胞的大规模扩张是非常低效率的。此外，二维附着改变了细胞的形状和几何结构，导致细胞变扁和细胞内细胞骨架和细胞核形态的改变，这反过来又改变了基因和蛋白质的表达。已有研究发现，细胞外基质(ECM)的组成和成分也能发出促进细胞分化的生化和机械信号。

2-D培养技术和其应用已在大多数原始和已建立的细胞系中得到实践，并标准化用于从显微镜使用和细胞计数到研究疾病进程和药物检测范围内的分析性试验。值得注意的是，2-D培养已经被用于定向分化干细胞成多种特定细胞，包括成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞，平滑肌细胞和肝细胞。然而，二维培养往往导致功能衍生物的缺失。研究还表明，二维单层培养不能准确再现动物生理学，并证明不足以验证药物发现。

总之，二维培养条件缺乏模拟干细胞微环境、动态和特定的三维(3D)微环境所需的复杂程度，而微环境负责调控体外干细胞的走向。在体内原生的三维微环境允许细胞、胞外基质组分和梯度营养、氧气、废物之间复杂的空间相互作用。三维微环境的影响是可以轻易在多能性干细胞中得到阐释：当注入另一个胚胎的内细胞团时，仍保持多能性，但由于外部诱因，在注射到动物其他部位时，干细胞自发分化为三个胚层。此外，在活体性腺、肠隐窝、毛囊和体内骨髓中也发现了支持多能干细胞的微环境，在此环境下，受体细胞释放信号控制多能干细胞持续自我更新或种系特异性分化。凭借体内微环境中的诱因，多能干细胞移植出微环境将导致其分化为不同细胞系的细胞。

为了解决干细胞二维培养所面临的各种问题，开发了三维培养方法，通过体外模拟干细胞微环境的胞外基质的组成和稠度将生理相关性和仿生微环境相结合来控制细胞的命运。然而，三维培养干细胞的维持和扩大仍然是一个挑战，主要是因为需要为不同类型的细胞进行培养条件的优化和分析。因此，阐明重要的干细胞维持机制是有必要的，包括有助于干细胞进行均匀和可持续扩增的同时不丧失遗传稳定性或分化潜能的生物材料信号传递和机械力。

近年来三维培养扩增干细胞，在数量和质量上已能够用于临床、制药和生物技术应用，本文聚焦在这些方面的进展。此外，我们将报告近期在二维培养方面的一些重要进展，因为这些技术在历史上导致了干细胞生物学的重大发展，并对早期的研究进行了回顾。总的来说，本文综述了多能干细胞的增殖和分化方面的最新进展。 

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二维培养技术

2.1 多能干细胞的维持与分化 

2-D培养研究聚焦在未分化干细胞特有的自我更新状态-干性的维持上，维持通过外部因素进行，如细胞及其三维微环境间的机械力，可以转换成能够控制细胞形态和功能的生物线索。

多能干细胞通常生长在涂有帮助附着的细胞外基质成分(如明胶、基质胶或胶原蛋白)或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层的塑料培养皿上。小鼠胚胎干细胞可通过在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层或含有小鼠胚胎成纤维细胞释放的细胞因子-白血病抑制因子（LIF）的培养基中培养来维持它们的多能状态。然而，补充白血病抑制因子不足以维持人胚胎干细胞的多能性，还需要在培养基中添加成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和转化生长因子β1(TGFβ1)。最近的证据表明，这些差异不是物种特异性的，而是发育差异性的。例如，人类胚胎干细胞和小鼠外胚层干细胞表现为扁平形态和低克隆性，而小鼠胚胎干细胞表现为三维凸圆形态，且单细胞克隆生长良好。最近的研究表明，通过在培养基中加入ROCK抑制剂以保护单个细胞免受凋亡从而提高细胞的增殖。已经提出在胚胎发育中有两个连续的多能状态，一个早期原始状态，之后是活化状态，各自派生出小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞。原始多能干细胞是一种早期全能细胞，能够分化为胚胎外组织和胚胎组织，而活化细胞来自于发育更高的状态，只分化为胚胎组织。

事实上，最近的研究已经证明人类胚胎干细胞在多能性上有能力从活化状态恢复到原始状态，这将大大提高人多能干细胞在培养时的增殖能力。此外，以下途径提高了胚胎干细胞的二维扩张： 

使用成分明确和无异质的培养基和附着基质，分别如E8培养基和人源重组蛋白玻连蛋白。然而，由于二维培养方法扩增多能干细胞费力，成本昂贵，而且需要高水平的专业知识，所以多能干细胞的均衡扩张仍然难以实现。

多能干细胞可分化为来源于所有三个胚层的细胞类型。一般来说，二维培养条件有利于多能干细胞的非特异性分化。然而，通过控制胞外基质、生长因子和附着基质的组成和组织，多能干细胞可以定向分化到特定的细胞系，这些物质可以发出决定细胞命运的机械信号。胚胎干细胞和诱导多能干细胞都可以使用类似的方案进行分化，但是，由于体细胞的本性和用于产生多能干细胞的方法，诱导多能干细胞表现出更大的变异性。在单层培养中使用特定的诱导培养基，胚胎干细胞已被定向分化为外胚层、中胚层和内胚层细胞类型，包括成熟的神经元和神经胶质细胞，成骨细胞，心肌细胞，肝细胞。单层培养的一个巨大优势是它允许对细胞的分化进行均匀的处理。因此，在利用合成基质进行二维培养和逐步地受控分化人类胚胎干细胞方面均取得了进步。例如，在单层培养中，使用MEF条件培养液然后再用激活素A和骨形成蛋白处理，胚胎干细胞被预先分化为包括心肌细胞的中胚层细胞类型的效率约为30%。不过，补加糖原合成酶激酶3和Wnt抑制剂可使胚胎干细胞向心肌细胞分化效率变为约80%-90%。同样地，分步策略也被用来分化胚胎干细胞，先分化为内胚层细胞，肝祖细胞，然后利用特定的生长因子分化为肝细胞。同样，使用补充了sonic hedgehog 蛋白拮抗剂以形成皮质样神经元的神经分化培养基，小鼠胚胎干细胞也被分化为外胚层细胞类型。 

然而，分化的神经元是异质性的，在体外不能显示特定的神经元特征。尽管分化较快，但二维培养的胚胎干细胞分化时往往获得分化细胞的混合群体。

2.2 骨髓间充质干细胞的维持与分化

与多能干细胞不同的是，骨髓间充质干细胞是自然粘附的，不需要异种基质来附着在培养板上，尽管它们通常是在含有动物血清的培养基中培养的。然而，最近，无异种物质的特定培养基已可用于扩大培养骨髓间充质干细胞。当培养基添加可溶性因子时可以保持胚胎干细胞的干性，而确切的骨髓间充质干细胞自我更新的机制尚不清楚。然而，模拟体内的微环境，如缺氧(2%O2)，已被证明能增强骨髓间充质干细胞的干性，引起细胞显著增殖，而且在6周培养期内不丧失多样性分化潜能。 

骨髓间充质干细胞在二维培养中的扩增效率很低。通常，细胞扩增是在多个组织培养瓶中生长以增加骨髓间充质干细胞大规模附着和繁殖的表面积。均匀的分布、生长和收获过程对于最大限度地减少异质性和提高细胞产量都很重要。在体外成功地培养骨髓间充质干细胞需要了解影响这些细胞增殖和诱导分化的信号通路。

大量研究表明骨髓间充质干细胞在二维培养中分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞以及心肌细胞。这通常是通过使用细胞特异性分化培养基来实现的及通过翻译和转录基因表达及胞外基质的组成进行评定。

然而，骨髓间充质干细胞在单层中的扩张会导致表型的改变，使纺锤形的骨髓间充质干细胞在传代过程中表现出一种宽而扁平的形态，进而反过来改变细胞的命运和分化潜能。特别是，与利用球粒或球体进行高密度细胞培养方法相比，2-D培养的骨髓间充质干细胞软骨分化效率较低。尽管骨髓间充质干细胞在2-D培养中具有限制性，但骨髓间充质干细胞被报道分化为多种细胞类型，不仅有中胚层细胞，而且有外胚层系细胞，包括视网膜前体细胞和感光细胞，神经细胞，以及肝细胞样细胞和胰岛样细胞等内胚层细胞系。然而，在体外诱导分化往往不足以产生功能上有活性能力的细胞。例如，骨髓间充质干细胞向视网膜神经节前体样细胞的瞬态分化被报道，这表明骨髓间充质干细胞在扩大培养过程中可能被去分化。虽然骨髓间充质干细胞是一种很有前途的细胞替代和免疫调节的来源，但要应用于临床仍有必要提高其分化方式。

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三维培养技术

由于二维培养技术的固有问题，人们试图设计三维培养方法以更好地再现初始的微环境。因此，如图1所述，我们探索了几种方法在静态和动态条件下，利用各种含有或不含生物材料的三维培养系统来维持、扩展和分化干细胞。 

3.1 静态三维培养

3.1.1 球状体 

最简单的三维培养方法之一是形成多细胞聚集体或球体，在没有补加物质的情况下，细胞和胞外基质之间进行三维相互作用。这些球体已被广泛应用于各种贴壁细胞类型，由强制或自发聚集技术形成，包括悬滴、旋转培养或悬浮培养中的低粘着培养板。球体由高度增殖、非增殖和凋亡细胞组成，氧气和营养物质向球体中心的扩散有限，导致低氧环境的加剧。由于球体的异质性，使得球状体被更多地应用于与同质细胞增殖进行比较，研究其复杂的三维细胞结构、细胞分化和肿瘤生物学。

代表性地，多能干细胞通过形成称为胚状体(EBS)的三维球体来诱导分化，这种胚状体能够自发分化为所有三个胚层。通过在培养基中添加细胞因子或生长因子，模仿胚胎发育和促进异质分化从而诱导分化为各种特定的细胞类型。尽管如此，固有的异质性使定向分化的再现性和胚状体的高通量筛选技术复杂化。胚状体的大小和数量已被发现影响分化效率，如在心肌细胞和造血分化。研究表明，分化也可以通过变化胚状体的大小来控制。由于胚状体是由多种微环境组成，对氧和其他可溶性因子的利用率不同，细胞在胚状体中的位置可以差异性地调节细胞命运。此外，大的胚状体倾向于分化为内胚层和中胚层细胞类型，而较小的胚状体倾向于分化为外胚层。 

与二维培养条件相比，三维球体培养从表型分析、肝细胞基因和蛋白质的表达以及细胞排泄胆汁代谢产物能力等方面提高了胚胎干细胞的肝细胞分化能力。胚胎干细胞的三维球体培养在内皮细胞管形成、功能胆管分化，肝祖细胞的植入潜能及造血分化中旁分泌信号发出等方面也有改善。总之，三维球体培养产生了胚胎干细胞的功能衍生物。然而，球体的长期悬浮培养常常导致细胞的聚集，由于在聚集体中营养物质和氧气的向里扩散和废物的向外扩散受到限制而导致坏死中心。

与胚胎干细胞相比，短期球体培养已被用于间充质干细胞的维持和扩大。当传代培养回到2-D培养条件时，球体培养生长的骨髓间充质干细胞呈现未分化形态，与贴壁培养的骨髓间充质干细胞相比，胞外基质沉积提高，分化潜能增强。骨髓间充质干细胞在三维球体培养时克隆生长和多能性增强，并且miRNA表达提高，多能基因，OCT 4，SOX 2和NANOG启动子区的乙酰化作用增强。

此外，短期培养3天的间充质干细胞球体表现出更高的抗癌因子和抗炎因子的表达，分别包括IL-24、TNFα相关的凋亡诱导配体，CD 82和TNFα刺激基因/蛋白6(TSG-6)和斯钙素-1。这些研究表明，三维球体培养可改善间充质干细胞的治疗性能。另一研究表明，球体培养的骨髓间充质干细胞对猪模型移植后的保留、存活和整合均有改善作用。然而，长期球体培养的骨髓间充质干细胞已经被证明能有效地诱导分化。 

与单层培养相比，在三维球体中生长的骨髓间充质干细胞显示出更高的软骨分化，以及在体外和体内的成骨分化，并且大鼠颅骨缺损骨再生增强。

利用这些方法进行大规模的干细胞扩大是很困难的，因为无法控制聚集体的大小，从而导致球体的聚集、球体坏死/凋亡，以及细胞增殖的抑制。这需要通过搅拌或掺入生物材料来尽量减少球体团聚，这将在3.2.1和3.2.2节中讨论。 

3.1.2 生物材料

天然和合成的生物相容性材料和生物降解材料可以提供各种生物信号和不同程度的机械强度。在体外培养时，生物材料已越来越多地被整合在一起以模拟干细胞生态位的生物化学和生物物理特性，从而帮助引导细胞自我更新或分化为特定的细胞系。天然生物材料的引入可能导致不同水平的诱导信号，细胞附着和支架完整性。天然生物材料，包括琼脂糖，纤维连接蛋白，1型胶原蛋白(Col1)，透明质酸(HA)，壳聚糖和海藻酸钠，也可以被功能化，但在体外更难控制，因为它们经常将生物信号传递给细胞。因此，生物材料可以帮助细胞维持与分化。然而，诸如批次间的差异性以及异种培养基成分引起疾病的可能性等问题限制了它们的使用。合成聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚-l-赖氨酸(PLL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和聚-dl-乳酸-乙醇酸(PGLA)，随着交联基团的加入常被最终功能化。聚乙二醇聚合物可能是最常研究的，因为它们无毒，易被功能化，并且表现低蛋白质吸附，因此它们应用于人类生物医学是安全的。

天然生物材料和合成聚合物正越来越多地被用作三维支架材料以维持、扩增和分化干细胞。具有可调力学性能的支架允许调控细胞活力、增殖和分化。限制在聚集体中心的细胞对氧和营养物质的可用性将导致休眠，并最终导致坏死/凋亡，通过这种方式，这种支架结构能够减缓对悬浮培养中干细胞的存活和生长有消极影响的细胞聚集现象。加入可溶性因子，如细胞因子或生长因子，或通过用于固着依赖性增殖的粘附配体进一步功能化，支架为用于干细胞自我更新和分化的胞外基质生产提供了构架。这些材料通过静电纺丝、溶剂浇铸、气体发泡、三维打印和自组装等多种技术形成了具有明显不同孔径、弹性、附着力和抗拉强度的支架。

两种类型的支架通常用于干细胞的三维培养。首先，预制或刚性支架需要细胞播种，或细胞迁移到支架。由于基底刚度、机械信号和生物材料信号对干细胞的分化非常重要，因此这些支架常用于分化步骤中。第二类支架在支架形成时自组装包裹细胞。生物材料的自组装通常通过各种交联方法来促进达成。物理交联支架通常被称为可逆凝胶和可通过pH或温度的可逆变化形成，获得机械力弱的支架。而通过化学交联形成的支架则会产生共价键，倾向于形成机械力坚固的支架。由亲水生物材料制成的水凝胶支架模仿天然软组织完全水合化的胞外基质，所以通常被用于干细胞的培养。 

水凝胶的组分也可以用药物、细胞因子和生长因子进行修饰，以支持细胞在体外的生长和分化以及细胞在体内的整合。水凝胶支架的尺寸限制了三维培养的规模由于在静置培养中营养物质的扩散问题。

一般来说，在三维水凝胶支架中维持胚胎干细胞需要通过支架降解来进行类似于二维培养的常规传代。人多能干细胞在温敏性水凝胶中的培养，每隔5天传代一次，至50代以上，约95%的细胞群体保持多能性。同样地，诱导多能干细胞在高孔电纺聚苯乙烯三维支架上呈现聚集体生长，在无异种条件下无数代的细胞保持了多能性和分化潜能。然而，理想的三维培养系统应该在减少常规传代需要的同时支持多能干细胞扩大，因此也限制了细胞的操作。

透明质酸底物常被用于支持多能干细胞的生长，因为透明质酸出现于胚胎发生过程中且在未分化细胞中高表达。另外，采用不同硬度的改性透明质酸水凝胶研究了三维培养条件下机械强度对胚胎干细胞的影响；通过模拟着床前囊胚内细胞团的微环境，胚胎干细胞在较软的水凝胶上生长最好的支持了胚胎干细胞在无饲养层和在小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液中的增殖和多能性。在光聚合透明质酸凝胶中延长三维培养20天0传代的人胚胎干细胞保持了多能性和自我更新潜力，这表明3-D水凝胶提供了一个支持胚胎干细胞紧凑克隆生长的仿生微环境。 

我们最近报道了用巯基功能化右旋糖酐(Dex-SH)和四丙烯酸酯功能化的聚乙二醇(PEG-4-acr)自组装的三维水凝胶对小鼠胚胎干细胞进行0传代维持培养达到超过6周以上。图2A描述了同时包封胚胎干细胞的自组装支架的形成原理，并在图2C-E对包封细胞的克隆生长进行了描述。有趣的是，胚胎干细胞的生长是独立固着的，因为支架缺乏粘附配体。此外，在培养的相当长一段时间内，生长在三维水凝胶中的胚胎干细胞内的三个多能性标记物OCT 4、NANOG和KLF 4的表达增强。在一些研究中也有类似的观测结果表明，维数和诱导生物材料信号都能影响胚胎干细胞的自我更新机制。例如，在用PGLA，胶原蛋白和壳聚糖制备的三种不同支架中培养的胚胎干细胞中，观察到了干性基因的差异调控，可上调OCT 4的表达，下调SOX 2的表达；而NANOG仅在壳聚糖支架中高度上调。综上，可以推测支架微环境在影响细胞-基质通讯中起着重要作用。三维培养的胚胎干细胞中多能性基因的上调机制值得未来继续研究下去。虽然在水凝胶支架中进行胚胎干细胞的三维培养有很大的发展前景，但进一步优化加入粘附配体和生长因子，可能有助于人胚胎干细胞的增殖。 

通过在体外模拟生化和机械信号，应用三维支架分化胚胎干细胞衍生物可改善以下过程：软骨形成，成骨生成，造血作用，神经形成，心肌细胞分化和肝细胞增殖。例如，Col1支架与纤维连接蛋白联合诱导形成血管和内皮分化，而加入层粘连蛋白则导致心肌细胞分化。 

在合成自组装肽支架和纳米纤维支架中的三维培养促进胚胎干细胞向成骨样细胞的分化。而添加明胶的纳米纤维PCL支架支持诱导多能干细胞的软骨分化[156]。与N-钙粘蛋白衍生肽(His-Ala-Val-Asp-Lle)结合的聚乙二醇水凝胶诱导小鼠胚胎干细胞的神经分化。经adhesive cue、RGD(Arg-Gly-Asp)序列修饰的藻酸盐支架支持胚胎干细胞和视网膜组织衍生物的视网膜分化。

为了研究力学性能对细胞分化的影响，我们将胚胎干细胞植入预制的聚二甲基硅氧烷(PDMS)支架上，支架的高弹性使其能够将机械信号传递给细胞。同样地，PDMS支架可以用于研究基体弹性的影响以及压缩或拉伸力的应用(图3)。在三维PDMS支架材料中进行小鼠胚胎干细胞的三维培养，由于PDMS基质的弹性和压力的传导，导致了选择性软骨分化。PDMS生长的胚胎干细胞多能性标记基因表达水平下降，同时软骨祖细胞基因标记增加。我们评估了PDMS支架培养小鼠胚胎干细胞7天后施加24小时压力(0.05MPa)的影响。在PDMS中生长的胚胎干细胞在压力下表现出分化成成纤维样形态(图3C-E)。因此，仿生支架有助于研究用于组织工程和移植应用的胚胎干细胞衍生物的分化和生成过程。间充质干细胞成纤维样细胞形态与肌动蛋白细胞骨架的组织结构和粘着斑的分布密切相关。 

尽管骨髓间充质干细胞的特征之一是在二维培养条件下贴壁生长，但对于在三维培养中附着的必要性存在着相互矛盾的报导。当支架与分别从纤维连接蛋白和层粘连蛋白衍生而来的粘着配体，RGDSP(Arg-gly-Asp-Ser-Pro)，和与IKVAV(Ile-Lys-Val-Ala-Val)序列在较小程度上结合时，光封装在非降解聚乙二醇水凝胶中的间充质干细胞表现出有所提高的存活率，这与在2-D粘附培养的间充质干细胞中的发现相似。应用补充有和未补充RGD序列的三维透明质酸水凝胶，研究了水凝胶支架中的间充质干细胞的扩散和增殖作用。骨髓间充质干细胞在两种水凝胶中均有增殖，但仅在RGD序列修饰的支架中观察到细胞的扩散。增殖受到基质硬度、交联密度、RGD浓度和随浓度的变化的支架降解速率的限制。然而，研究结果表明，即使没有细胞粘附配体，水凝胶降解显著提高了骨髓间充质干细胞的存活率。

同样，我们观察到在Dex-SH/PEG-4-ACR自组装支架中的脐带来源的骨髓间充质干细胞(图4A)没有显示明显的增殖或骨髓间充质干细胞成纤维样形态(图4B-C)。用1型骨胶原蛋白纤维制备了dex-SH/PEG-4-acr自组装支架，粘附的Cy3标记的骨髓间充质干细胞显示成纤维样细胞形态，共聚焦显微镜下观察到了细胞增殖(图4D-E)。

骨髓间充质干细胞的三维培养可以提高体内移植的适应性，促进体内免疫抑制的吲哚胺2，3-双加氧酶、IL-6、M-CSF、IL-10、转化生长因子β、HGF和PGE 2因子的分泌。

据报道，培养的间充质干细胞能改善细胞植入的预后。例如，在三维骨胶原-支链淀粉水凝胶中生长的骨髓间充质干细胞可诱导分泌血管生成细胞因子，血管内皮生长因子-a(Vegf-a)和单核细胞趋化蛋白-1(Mcp-1)。水凝胶培养间充质干细胞移植物分化为成纤维细胞和内皮细胞，从而促进创面愈合和新生血管生成。封装在3-D 透明质酸水凝胶的骨髓间充质干细胞与巨噬细胞共培养后，CD 16和HLA-DR更低，CD 206表达增加，这显示其可能更适合用于移植。有趣的是，与在2-D培养条件下生长的间充质干细胞相比，三维维骨胶原-支链淀粉水凝胶中生长的骨髓间充质干细胞具有增强的自我更新能力和多能基因，OCT 4、SOX 2和KLF 4的表达。

模拟体内微环境的三维培养条件也被研究以分化间充质干细胞。支架的机械刚度和载荷性能促进了骨髓间充质干细胞分化为不同的特定细胞系。例如，较软的基质诱导间充质干细胞分化为神经和β胰岛细胞，以及分化为软骨细胞和脂肪细胞，然而，增加基质刚度则支持间充质干细胞分化为成肌细胞和成骨细胞。更坚硬的基质也能增强整合素结合和诱导成骨分化。模拟接合作用的压缩力通过动力传导支架增加间充质干细胞中软骨生成基因的表达，诱导间充质干细胞向软骨细胞分化。 

含有胶原蛋白的支架作为结缔组织细胞外基质的主要成分，已被用于分化间充质干细胞为中胚层细胞系，包括成骨细胞，软骨细胞和心肌细胞。骨髓间充质干细胞在模拟软骨细胞外基质的透明质酸组成的三维支架中培养分化为软骨细胞系。 

骨髓间充质干细胞在机械性强的多糖-壳聚糖组成的三维支架中培养，促进其成骨分化。相反，脐带来源的间充质干细胞在软的3-D藻酸盐支架中分化为神经元。因此，对于诱导间充质干细胞分化为特定细胞系来说，优化三维支架的组成和力学性能是非常重要的。

总之，通过利用机械信号、可溶性因子的空间梯度、细胞-细胞和细胞与胞外基质间的交互作用，现有的培养技术可提高维持和扩大间充质干细胞的三维培养。这些研究可以揭示基本的细胞生物学过程和机制。在静态培养中使用单个支架进行大规模细胞扩大仍是一个挑战。如果支架的大小增加，由于支架中的氧、营养物和废物的进出扩散，支架中心的细胞生长可能受到限制。往动态培养体系包括搅拌和流注灌注系统中补料的方法，目前正被用于控制培养条件，使体外生长更加均匀。

3.2 动态三维培养

治疗、制药和生物技术应用都需要大量的同质高质量细胞，传统的二维培养技术是不可行的。动态生物反应器有助于在高密度下培养细胞，使细胞生长可重复，并使在二维培养细胞扩大时最小化其可见的可变性。生物反应器中细胞的大规模扩大需要有明确的、规范化的培养条件，包括pH值、温度、溶解氧浓度以及代谢产物和废物的去除。在静态培养中，当细胞在高浓度下接种、还原氧和营养物质转移和大细胞聚集增加细胞死亡时，会发生细胞聚集。 

生物反应器有多种设计，从单个细胞的扩大或分化到整个组织的培养均可广泛应用。由于成本低，使用方便，旋转瓶是最常见的，通过内部叶轮允许改变搅拌速度连续搅拌悬浮细胞。这种方法导致水动力剪切力，使细胞与氧气和营养物质混合，获得一个更均匀的环境，然而，过度的搅拌导致细胞死亡。因此，旋转壁容器被设计为通过水平旋转来限制剪切力，允许在没有内部搅拌机制的情况下进行培养混合。培养参数可以通过流量灌注系统来控制，使营养物和废物持续交换，与分批式生物反应器系统对比，由于时间推移，代谢物和废物积累，后者在规模上和培养时间长度上都受到限制。因此，必须定期更换培养基，以限制废物堆积的抑制作用，或者就必须在多个生物反应器中接种细胞以实现大规模的细胞扩大。最后，模拟组织生理学，利用压缩力和拉伸力的机械力生物反应器已经被开发出来，并且越来越多地用于接合组织为细胞分化进行工程构建。这些技术可以通过使用生物材料(即微载体和微胶囊)来进一步改良，如下文所述的，这些生物材料可用于高浓度悬浮培养的细胞的生长。总的来说，细胞的生长和命运取决于培养条件，包括细胞接种密度、培养基成分和生物材料的掺入。

3.2.1 微载体

微载体，约100-300μm的小珠，由各种材料组成，包括聚苯乙烯、明胶、葡聚糖和胶原蛋白，合成后具有多样的多孔性和形貌。悬浮培养中，它们为固着依赖型细胞提供了粘附表面。细胞在微载体上的粘附可以优化，以促进细胞的扩增或分化。微载体还限制了细胞的聚集，并为细胞生长到高密度提供了大量的表面面积，从而可以通过酶解离收集浓缩的细胞。

旋转瓶和微载体的动态培养技术已被证明支持人胚胎干细胞向高密度增殖。通过在微载体表面包被粘附蛋白已实现多能干细胞的附着。纤维素微载体包被一类胞外基质蛋白-人工基底膜，被用于人类胚胎干细胞长期扩大和维持。纤维素微载体包被胞外基质蛋白，如玻连蛋白，层粘连蛋白或PLL，已被证明能促进干细胞的多能生长。事实上，在无异种无动物来源材料的条件下，在连续灌注生物反应器系统中观察到附着在微载体上的人类胚胎干细胞的生长速度增加了12倍。

利用微载体进行三维培养的其中一个主要优点是可以利用分化培养基进行扩增和随后分化为特定的细胞系。利用微载体对人类胚胎干细胞进行更高质量的扩大，体现在其形成胚状体的效率比在二维培养条件下生长的细胞高10倍。微载体也被发现支持分化胚状体为血液血管母细胞，血液血管母细胞可分化为造血细胞和内皮细胞。胚胎干细胞向心肌细胞的扩大和分化都是通过使用微载体旋转培养技术实现的。 

胚胎干细胞衍生的心肌细胞表达细胞特异性转录因子、离子通道基因和肌动蛋白。同样地，使用胶原蛋白涂层的微载体，胚胎干细胞首次扩大到45倍，然后利用分化培养基将其分化为内胚层细胞系，特别是胰岛细胞和肝细胞。然而，还不确定使用微载体分化胚胎干细胞是否是可行的。在其中一项研究中，用搅拌式生物反应器中的微载体培养胚胎干细胞，其衍生的肝细胞分泌的蛋白质水平低于原代肝细胞。

在悬浮培养中，微载体也被研究以放大间充质干细胞的增殖。骨髓和胎盘来源的骨髓间充质干细胞已使用微载体在动态生物反应器中培养放大。然而，与在静态培养瓶中的扩大相比，细胞活力和增殖能力更低。在动态生物反应器中生长并在微载体3-胶原包被葡聚糖基微载体上扩大时，来源于不同骨髓供体的骨髓间充质干细胞表现出不同的增殖率，在二维培养中表现出类似的生长特性。开展了相似的研究，检测了不同的微载体，观察到了来源于不同骨髓样品的间充质干细胞在SoloHill塑料珠上培养时的可再生生长，这意味着生物材料信号在间充质干细胞的增殖中起着重要作用。因此，确定合适的微载体对间充质干细胞的扩大具有重要意义。此外，各种培养参数，包括氧浓度、搅拌速率和养分交换是实现间充质干细胞的更高增殖的重要考虑因素。

人们对利用微载体分化骨髓间充质干细胞表现出相当大的兴趣[195，208-210]。数个报导表明微载体有助于间充质干细胞分化为成骨细胞系[195]和软骨细胞系[208，209]。事实上，可生物降解的聚已酸内酯微载体支持胎儿的间充质干细胞在体外向成骨细胞分化，与二维培养的细胞相比，在移植时表达更高水平的成骨基因和钙沉积和等效的骨形成。同时释放转化生长因子β3的微载体表现出可提高骨髓间充质干细胞的软骨分化。在另一项研究中，在微载体上接种的间充质干细胞移植到小鼠骨关节炎模型后，表现出更高的软骨再生。尽管利用微载体在生长和分化骨髓间充质干细胞方面取得了一些成功，对已分化的细胞的功能状态仍应进一步地进行研究。

3.2.2微型胶囊

与主要有助于细胞附着到珠子表面的微载体相反，微囊化是将细胞固定在半渗透性材料或膜内的过程，允许细胞生长所必需的营养物质、氧气和生长因子进行自由扩散。球形囊内细胞微胶囊化过程不仅可用于对抗悬浮培养中的团聚和剪切力，同时也能防止移植后的免疫反应。依据所用生物材料的组成和生长因子的掺入，微胶囊微环境可以被调控以保持干性或诱导干细胞分化。通常在乳化或挤压过程细胞被胶囊化，在细胞周围形成保护性胶囊，并允许细胞在囊内生长。海藻酸和琼脂糖是两种最常用的生物分子，分别通过光交联和温度依赖凝胶化进行包封细胞。软性海藻酸胶囊通常用机械性强的聚合阳离子(即壳聚糖、聚乙二醇、PLL)涂层来提高胶囊的完整性。此外，由于琼脂糖胶囊缺乏粘附性能，它们可以通过加入其他生物材料来改良，如胶原蛋白或明胶，以促进细胞的附着和生长。

维持细胞种群的活性和多能性以及同质性，是大规模扩大胚胎干细胞的必要条件。防止细胞聚集和改善条件使得允许营养物质、氧气和生长因子扩散是非常重要的。琼脂糖中的微胶囊可防止细胞聚集，并且使胚胎干细胞生长更快，而不发生坏死。一般来说，多能干细胞的包被已被证明能保护细胞免受化学和机械力，包括水力的剪切力，这种剪切力对悬浮培养中的细胞活性有负面影响。包裹在海藻酸钙水凝胶微胶囊中的胚胎干细胞在无异种条件下生长能延长培养期，而且不影响细胞活性和多能性。

包裹在藻酸盐珠子中的胚胎干细胞分化成能够产生胰岛素的β细胞。此外，胚胎干细胞也被分化为能够分泌白蛋白和尿素的肝细胞，这提示微胶囊有助于胚胎干细胞分化为功能性内胚层衍生物。同样，微胶囊化也促进了胚胎干细胞的中胚层分化。在PLL包被的海藻酸钠胶囊中生长的胚胎干细胞分化为高水平表达Nkx2.5和GATA 4的心肌细胞。然而，被包裹在用RGD序列修饰的PEGDA微胶囊中和HA水凝胶微囊中的胚胎干细胞支持被分化为软骨细胞。在磷酸钙骨水泥微囊中培养可促进胚胎干细胞的成骨分化，促进骨再生。藻酸盐三维培养可促进胚胎干细胞向外胚层分化，和经透明质酸修饰的海藻酸钠可提高胚胎干细胞向表达突触标志的神经细胞分化。总之，三维微胶囊培养扩大和分化胚胎干细胞被证明可能是组织工程应用中不可或缺的。 

微胶囊化的骨髓间充质干细胞常用于免疫调节，移植后导致纤维化减少，炎症减少。因为骨髓间充质干细胞的扩大更依赖于固着，用粘着配体和或胞外基质组分对微胶囊进行改性可以促进细胞的扩增和分化。与静态培养相比，动态培养提高了藻酸盐微胶囊包裹的间充质干细胞的增殖。然而，间充质干细胞包裹在加有粘附配体的海藻酸钠中仍能存活，但没有增殖，这表明单独附着对细胞生长而言是不够的。当海藻酸钠包裹的间充质干细胞被施加压力而非剪切力时，它们分化为软骨祖细胞。间充质干细胞包裹在用RGD序列修饰的藻酸盐微胶囊中可持续释放转化生长因子β1，诱导其分化，增加软骨生成基因表达和体外基质沉积，促进体内软骨再生。用钙改性海藻酸钠微囊三维培养时，间充质干细胞优先分化为软骨细胞系，也可观察到胞外基质的生产增强。通过矿化海藻酸钠和PLL包被的海藻酸钠，以及胶原蛋白和琼脂糖改性胶原蛋白和壳聚糖微胶囊处理，微胶囊技术还被用于促进间充质干细胞在动态三维培养中的成骨分化。除分化外，为体内修复退行性组织的同时尽量减少免疫反应，微囊化间充质干细胞可能被证明是间充质干细胞衍生物的一种有利的细胞传递方法。

与微载体和微胶囊结合使用的动态生物反应器具有提高细胞的质量和数量的潜力。但是，许多挑战依然存在，包括细胞聚集后的分化潜力，基因表达改变，流体动力剪切力的产生和培养的可变性。 

因此，需要进一步的研究，将动态生物反应器与生物和工程组分结合用于获得干细胞最优的扩大和分化。 

3.2.3 微流体

无论在体积还是尺寸上都是小规模系统的微流体越来越多地被研究用于培养细胞。它们可以通过灌注培养基交换和可溶性因子的化学梯度来模拟活体微环境来进行单细胞分析。他们被用来研究细胞分泌信号和微环境对干细胞命运的影响。这些进展导致了整个器官系统设备的发展，如模仿人体的微环境的“器官芯片”。

微流体可以控制可溶的微环境，而微环境又可以调节细胞间的自分泌/旁分泌信号，以及水动力流速引起的剪切力。在微流体中灌注培养4天，小鼠胚胎干细胞在更高的流速时增殖，但在最慢流速下不增殖。在无饲养层的微流体室中培养小鼠胚胎干细胞形成集落，并表现出增高的 LIF表达，几乎是高于在宏观培养条件下分泌的140倍，提示内源性信号可能在决定干细胞的命运中起着重要的作用。 当LIF分泌受到抑制时，胚胎干细胞优先分化为中胚层细胞系。通过改变培养条件、流速和增强外源的生长因子，微流体培养系统也可用于诱导胚胎干细胞的分化。缓慢流动的微流体支持小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞和雪旺细胞样细胞。

此外，不连续灌注培养中流速的变化允许胚胎干细胞直接分化为心肌细胞和肝细胞，这些细胞在微流控培养系统中表现出功能表型和对药物治疗的反应。

与多能干细胞相似，微流控培养系统可用于骨髓间充质干细胞的小规模增殖和受控分化。采用微流体微团培养法连续灌流培养，骨髓间充质干细胞增殖34倍。随后，诱导生长因子的加入导致了骨髓间充质干细胞(MSCs)向同质软骨分化。恒定微流体灌注培养使骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞分化，这种细胞表达细胞特异性基因并能够摄取低密度脂蛋白，暗示功能性细胞。微流控装置中极低流体剪切力的应用诱导了间充质干细胞的细胞迁移和成骨分化。通过微流控装置中的动态拉伸和周向应变模拟活体血管力学生物学，导致间充质干细胞分化为血管样细胞。经过IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤) 和流体剪切力处理的骨髓间充质干细胞向神经细胞分化增加了3倍。微流控培养技术尚处于起步阶段，但有望用于阐明生物过程、组织工程学和制药应用。

总之，多种三维培养技术对干细胞的增殖和分化均表现出增强作用。如图5总结的期望的应用，每个三维培养系统都有各自的优缺点。一般来说，这些技术在复杂性和可控性上都存在差异。例如，球体的形成是一种非常简单的技术，在没有生物材料加入的情况下，可使细胞与胞外基质进行三维的相互作用。然而，球体培养会导致细胞群体和微环境的异质性，包括坏死/缺氧核的形成。

生物材料的加入可通过模拟体内胞外基质诱导生物化学和机械信号转导来提高细胞的生长和分化。要确定三维支架的合适的生物材料和力学性能则必须针对每种细胞类型和应用进行优化。此外，由于批间差异，生物材料来源的支架可能导致重复性差。 生物反应器支持干细胞的大规模生长和/或分化。静态生物反应器受到在没有生物材料(微载体或微胶囊)的情况下细胞聚集和受到批量更换培养基的限制。相反，通过搅拌和培养基灌注分散复杂的均质培养基和细胞，可使得动态生物反应器高度可控。然而，这些方法成本高昂，而且细胞还受到引入可被使用生物材料而限制的水动力应力的影响。在大规模培养过程中，需要进行额外的优化，以确定理想的培养参数和细胞分析手段。

4

挑战

自从人类胚胎干细胞分离以来，在利用选择性培养基了解其自我更新、多能性和分化机制方面取得了重大进展。同样的，间充质干细胞从不同的组织中分离、培养并分化为中胚层系。此外，用于临床目的，新的无异质培养基已被开发用以培养干细胞。 然而，在造血干细胞和祖细胞等其他干细胞的繁殖方面的进展仍然很少。即使是胚胎干细胞和间充质干细胞的扩大和分化也面临着许多挑战。这些挑战包括： 

4.1 培养的细胞的不均一性

2-D培养技术固有的低效性、劳动密集性和昂贵性，对干细胞的扩大有一定的限制。此外，2-D培养产生了各种各样的干细胞和衍生物。胚胎干细胞和间充质干细胞在2-D培养条件下有非特异性分化的倾向。即使干细胞定向分化成特定的细胞系，通常也只是部分地完成，而且分化的衍生物缺乏功能性。此外，在二维培养条件下扩张的细胞的生存、整合和功能受到限制。总的来说，二维培养的规模扩大是很困难的，在2-D培养条件下常常不能成功模拟体内微环境以进行干细胞的维持和分化。

4.2 克隆生长

克隆生长与干细胞的自我更新有关。干细胞克隆生长的下降表明干细胞的自我更新能力降低且干细胞的扩大受到限制，对于成体干细胞如间充质干细胞来说尤其明显。已经证明，传代降低了间充质干细胞的克隆性生长，增殖能力和自我更新潜力。单细胞分离后，人胚胎干细胞生存不良，丧失克隆原性，限制了增殖潜能。单细胞的同步克隆生长对于获得同质细胞群体是很重要的。因此，骨髓间充质干细胞和多能干细胞培养方面的改进对于这些细胞的大规模和长期扩大来说是必不可少的。

4.3生物材料

通过加入生物材料以模拟天然3-D微环境的生物化学和生物物理特性通常能促进三维培养。多种天然和合成生物材料被用来开发合适的支架来模拟细胞在体内生长的条件。

然而，通常很难确定哪种生物材料对于特定类型的干细胞的生长和分化是最适合的。例如，在培养中使用不同的生物材料引起的变异性和下降的可重复性。生物材料也已知在可能影响干细胞的维持和分化的信号转导中起作用。因此，需要进一步的研究以找到能提高培养细胞的质量和数量的合适的生物材料。

4.4培养条件优化

尽管有关干细胞生长和分化的文献数量迅速增加，但缺乏标准的细胞培养方法。2-D培养方法操作简便，常见，但效率不高。我们需要努力开发三维培养系统，这一系统虽然效率更高，但涉及到许多参数，包括培养基组成、生物材料、机械力、氧含量、pH值和培养基灌注量，这些参数对培养细胞的质量和数量均有影响。此外，细胞的聚集和养分/废物交换的扩散对培养方法的标准化也是非常重要的。这会导致细胞群体的异质性、坏死和细胞增殖的抑制。

最近在使用各种生物反应器扩大或分化干细胞方面的进展令人鼓舞。与静态生物反应器相比，动态生物反应器展现出更大的应用前景。然而，动态生物反应器采用搅拌或培养基灌注会引入流体动力学剪切力，对细胞活率产生不利影响。

4.5 机能活动

任何培养方法的其中一个主要考虑因素是培养的细胞应具有最佳的活力，并具有与体内细胞相当的功能活性。这些细胞也应该能够在体内存活并整合到组织中。暴露于低氧应激下的细胞在移植后表现出更容易存活。因此，细胞的再生应该是一个重要的考虑因素，优先于考虑用于临床的目的。此外，开发从干细胞中获得分化均匀的细胞的有效方法可能有助于产生可重复的结果，但具有挑战性。未来的研究应该集中在研究暂时性因素，利用适当的生物材料来设计专门用于干细胞的生长和分化的微环境来仿真模拟体内条件。

4.6 培养规模化

目前迫切需要为各种生物医学应用生产大量高质量的细胞。目前的细胞扩增方法生产了数百万个细胞，而这些细胞是对个别病人有限的自体使用。即使是这样，也可能没有效果，因为最近的研究表明，更高浓度的移植细胞更有效。同种异体细胞治疗的多中心临床试验需要数十亿到数万亿的细胞。将细胞规模扩大到这一水平需要在培养基、培养设备和技术方面取得重大进展。细胞大规模培养的一个优势是在临床试验中可用于多种患者的细胞治疗，并且其结果可以相互关联。然而，大规模生产系统涉及到生物反应器和GMP设施，需要生物医学研究人员和工程师之间的合作。此外，一些技术的结合，包括用生长因子或配体修饰的生物材料以及其他生长参数以最优地生长和分化干细胞成特定的细胞类型，对细胞治疗、组织工程和再生医学等领域的进一步发展是必不可少的。

5

结论

最近，在干细胞培养方面，特别是在使用生物材料和生物反应器方面被报导取得了重大进展。这些三维培养方法不仅克服了二维培养相关的局限性，而且也有潜力扩大细胞到如临床试验，制药或生物技术应用需要的十亿倍。用生物诱导、生物降解和生物相容性聚合物模拟在天然微环境中发现的胞外基质、维度和空间梯度进行细胞三维培养，不仅有助于扩大和功能的改进，而且适合于干细胞的定向分化。需要生物反应器和GMP设施的细胞大规模生产将受益于生物医学研究人员和工程师之间的多学科合作。尽管面临挑战，三维培养系统的进步将为加速干细胞用于治疗许多无法治愈的疾病的治疗性应用提供动力。 

图2. 绿色荧光蛋白(GFP)标记的小鼠胚胎干细胞在自组装支架上的三维生长。

(A)自组装支架形成和封装小鼠胚胎干细胞的示意图 (B)自组装支架的图像，(C-E)分别代表荧光绿色标记胚胎干细胞在Dex-SH/PEG-4-Acr自组装水凝胶中生长2,7和21天的复合共聚焦图像。3-D培养的胚胎干细胞表现出无分化的克隆生长。标尺= 100 μm. 

图3.GFP标记小鼠胚胎干细胞在预制PDMS支架中的三维生长。

(A)涉及机械力(压缩力或张力)的预制PDMS支架中植入胚胎干细胞的示意图  (B) PDMS支架的宏观图像，(C-E)分别代表绿色荧光标记的胚胎干细胞在预制PDMS支架中生长2天、7天和21天的共聚焦图像。在第7天，将胚胎干细胞接种到支架上以0.05 MPa压力压缩24小时，然后继续培养2周。压缩PDMS支架可诱导胚胎干细胞分化为软骨系，因其成纤维样细胞形态。标尺= 100μm  

图4.来源于人脐带的Cy3标记的间充质干细胞在三维自组装支架中生长。

(A)二维培养的间充质干细胞的光学显微图。(B-E)分别代表红色荧光标记的间充质干细胞在1型胶原蛋白 (Col1)缺失和存在的Dex-SH/PEG-4-Acr自组装支架中生长1天 (B和D)和7 (C和E)天的共焦图像。间充质干细胞在添加Col1的三维支架中培养时表现为成纤维样细胞形态。标尺= 100μm。 

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