NSCLC免疫治疗之预测标志物

PD-1/PD-L1 或者CTLA-4抗体疗效神奇，但并不是所有患者都能从抗体的疗效中获益，例如肺癌的整体获益患者比例不超过30%（Curr Opin Pharmacol. 2015 Aug;23:32-8.）。基于分子标志物检测的用药指导，能显著提高有效率。免疫药物作用机理复杂，基于单一指标的用药检测局限较大。目前公认的免疫检测标志物类型主要包括以下三类：肿瘤新生抗原（TMB、MSI、HLA等）、PD-L1表达和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL，Tumor Infiltrating Lymphocyte）。而研究报导较多的主要是TMB和PD-L1。下面介绍两篇关于TMB和PD-L1的研究。

Genomic Features of Response to Combination Immunotherapy in Patients with Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.   CANCER CELL，2018.05.14

研究背景

 肺癌患者应用免疫检查点抑制剂联合治疗具有良好的临床获益，但其疗效预测指标尚不清楚。 本研究分析了75例NSCLC IIIB和IV期（59例非鳞癌、16例鳞癌）接受Nivolumab(PD-1抑制剂)和Ipilimumab(CTLA-4抑制剂)联合阻断治疗的患者，重点研究两方面：鉴定免疫联合治疗疗效的预测性生物标志物（主要针对肿瘤突变负荷TMB和PD-L1）；评估联合治疗的方法对于响应的频率（frequency）、深度(depth)和持续获益时间的提高程度。

结果

一、TMB（肿瘤突变负荷）与联合免疫治疗获益相关

Fig.1 TMB与联合免疫治疗获益之间的关系

• 客观缓解（CR 或PR）和持续临床获益（DCB；缓解或稳定期>6个月）的患者分别相比未客观缓解（SD或PD）和未持续临床获益(NDB)的患者，TMB较高；（TMB 273 VS. 114mutations和TMB 210 VS.113mutations）（Fig.1a）横坐标是临床获益分组，纵坐标是TMB值大小。

  
  

• TMB高(>median,158mutations)的患者ORR(51% VS.13%)、DCB率(64% VS.34%)和PFS均比TMB低的患者高；（Figb、c）横坐标是TMB高低分组，纵坐标是患者数目，图中不同颜色代表获益类型；

  
  

• TMB与ORR和DCB之间有很强的相关性（Fig.1d）；ROC曲线分析，横坐标代表特异性，纵坐标是灵敏度。

  
  

• 使用TCGA数据库中NSCLC患者的TMB值的四分位数为标准（四种颜色线），对本研究的患者队列进行分组，发现各组间的PFS有显著差异；TMB值越高，PFS越长；（Fig1e）横坐标是治疗时间，纵坐标PFS比例，图中不同颜色代表TMB值大小分组。

二、TMB与临床获益率相关性最强，基于新抗原负荷与TMB值显著相关

Fig.2 TMB和计算得到的新抗原负荷之间的关系

• TMB和计算得到的新抗原负荷高度相关(spearman ρ 0.92,P<0.0001)（Fig.2），TMB越高，肿瘤产生的neoantigen越多，肿瘤免疫原性越强；横坐标是TMB取log值，纵坐标是新抗原负荷预测值取log值，两者进行相关性分析；

  
  

• 新抗原预测：使用Topiary软件，将突变DNA序列模拟转化成对应突变后蛋白质；通过NetMHCcons模拟预测突变蛋白与病人MHC  I型亲和性。结合亲和力IC50<500nM被认为候选新抗原，亲和力IC50<50nM被认定为强结合新抗原。

三、在疗效预测指标中，TMB与PD-L1表达是相互独立的两个预测因素

Fig. 3 TMB与多变量疗效之间的相关性

• 在75人队列中的70名（93%）患者中，对TMB和肿瘤PD-L1表达不同临床疗效患者中（CR/PR，完全缓解/部分缓解；SD/PD，疾病稳定/进展）进行分析，发现PD-L1表达和TMB之间没有显著相关性（Fig.3a），为两个独立的临床疗效预测因子；横坐标是TMB值大小，纵坐标是PD-L1表达量高低，不同颜色点代表不同疗效的患者。

  
  

• ROC曲线，在CR/PR患者中，多变量相关分析中加入PD-L1表达、组织学、吸烟状况等变量，分析结果显示，TMB与ORR和PFS独立相关；图3中实线是加入PD-L1表达、组织学类型、吸烟状况、身体状况等的多变量分析，虚线是TMB单变量分析曲线（Fig.3b）；图c中紫色实线是6个月多变量分析，紫色虚线是6个月TMB单变量分析；黄色实线是12个月多变量分析，黄色虚线是12个月单变量分析。单变量分析时两条曲线评估接近，受其他因素影响较小，与ORR和PFS独立相关（Fig.3c）；

  
  

• TMB高和PD-L1表达量高，双重指标阳性的患者获益最大，其次是一个指标阳性，获益明显高于双指标阴性的患者（Fig.3d），蓝色是临床获益的患者数，白色是疾病进展的患者数；横坐标是获益类型分组，纵坐标是患者数。

总结

以上文章对PD-1和CTLA-4联合阻断治疗的NSCLC患者进行全外显子测序，发现TMB对客观缓解率（ORR）、持续临床获益（DCB）和无进展生存期（PFS）有很好的预测作用。TMB与PD-L1表达相互独立，且为多变量相关分析中与临床获益关联性最强的遗传学特征，TMB低的NSCLC患者的缓解率相对较低。

TMB如此重要，检测方法至关重要。检测方法有哪些？下面研究比较了临床常用的两种测序方法在TMB中应用。

Molecular Determinants of Response to Anti–Programmed Cell Death (PD)-1 and Anti–rogrammed Death-Ligand 1 (PD-L1) Blockade in Patients With Non–Small-Cell Lung Cancer Profiled With Targeted Next-Generation Sequencing. Journal of Clinical Oncology  March 1, 2018

研究背景

大多研究采用了全外显子测序的方法计算TMB，受到实用性的限制，无法像靶向NGS方法成为临床常规检测手段。本篇研究纳入240例接受靶向NGS测序并接受PD-1/PD-L1治疗患者样本，一部分患者同时进行WES和靶向NGS测序，结果用于比较两种方法计算得出TMB的一致性。

本文中使用的靶向NGS，240例患者中，56人使用MSK-IMPACT version 1（341个基因的全部外显子与部分内含子），164人使用MSK-IMPACT version 2（410个基因），20人使用MSK-IMPACT version 3（468个基因）。DNA提取自肿瘤组织与配对外周血样本。49例患者同时使用WES与MSK-IMPACT测序，WES平均覆盖度为150X。

TMB（肿瘤突变负荷）计算方法：体细胞非同义点突变个数/Mb

结果

WES和靶向NGS测序方法计算的TMB高度相关，且与临床治疗获益相关

• 为验证NSCLC中，靶向NGS是否可以准确定量TMB，文章同时进行WES与靶向NGS测序的49例样本的测序并各自计算TMB，进行线性回归分析，最终结果成高度正相关(Spearmanρ=0.86;P<0.001)(Fig.1a)，横坐标是靶向NGS计算TMB，纵坐标是WES计算的TMB；

Fig.1 与免疫治疗反应相关的体细胞分子特征

• 根据靶向NGS结果计算的TMB，DCB组明显高于NDB组分布（中位数，8.5 vs 6.6 SNVs/Mb; p=0.0062），CR/PR组TMB分布也明显高于SD或者PD组（中位数，8.5 vs 6.6 vs 6.6 SNVs/Mb; p=0.0151 ）（Fig.1b），横坐标是临床疗效分组，纵坐标是TMB值；

  
  

• 文章分析了随着TMB切值的提升如何影响ICI治疗的DCB率和PFS。当把TMB按照四分位方法依次分层，发现DCB比例与PFS也会随着TMB分层的提升而增加。图c横坐标是百分位数，值越大，代表TMB值越高，纵坐标是持续临床获益DCB缓解率（Fig.1c）；图d横坐标是时间轴，纵坐标是PFS时间，图中不同颜色曲线是代表不同TMB值大小区间，TMB值越高，PFS越长（Fig.1d）；

  
  

• NDB组的拷贝数突变比例（FGA）高于DCB组（Fig.1e），且显著高于为ICI治疗的NSCLC患者（中位数，0.16 vs 0.11, P=0.007）。FGA与ICI（免疫治疗抑制剂）应答负相关，与TMB分布正相关。横坐标是临床获益分组，纵坐标是拷贝数突变比例值（FGA）。

结论

大Panel靶向NGS(二代测序)可准确估算TMB，随着TMB的提升，ICI（免疫治疗抑制剂治疗）获益率可能性也在升高。

延伸讨论

1.TMB高低和PD-L1表达是相互独立的两个指标，且都与临床获益相关。PD-L1低的，可以测一下TMB；TMB低的，可以再测一下PD-L1。                                  

2.研究发现，目前公布的各大常见肿瘤接受PD-1抑制剂治疗的有效率，和TMB大小几乎是线性关系。TMB越大，PD-1抑制剂有效率越高。(Tumor Mutational Burden and Response Rate to PD-1 Inhibition. NEJM.2017)

Fig.2 抗PD -1或抗PD-L1治疗与27种肿瘤类型的肿瘤突变负荷与客观反应率的相关性。

横坐标是每一种常见肿瘤中位的突变个数，也就是TMB的大小。纵坐标是从目前已经开展并公开发表的临床试验数据中，汇总出来的每一种常见肿瘤接受PD-1抗体治疗后的有效率。比如dMMR的肠癌、非肠癌有效率都在30%-40%；最高的是皮肤鳞癌，突破了50%，最低的是胰腺癌、生殖细胞肿瘤等，有效率低于5%。每一种肿瘤都根据它的TMB大小以及对PD-1抑制剂的有效率，在图中画出坐标点。同时用圆圈的大小，来代表样本量的大小。

3. TMB与疗效正相关的本质源自TMB越高，肿瘤产生的neoantigen越多，肿瘤免疫原性越强。MSI和TMB的关系：MSI可以理解为TMB的一种子集、一个特例。几乎所有MSI高度不稳定的病人，TMB都是高的；但是反过来，TMB高的病人，并不一定都是MSI不稳定的，还有相当一部分病人是MSI稳定型的。dMMR（错配修复缺陷）会导致基因修复出现问题，从而编码出更多的新抗原，TNB也越高；HLA杂合性缺失的出现则影响了新抗原递呈到肿瘤细胞表面，降低了肿瘤细胞被T细胞识别的概率，进而负向调节了免疫治疗效果。

4. 多种生物标记物的组合可能为治疗效果提供更强的预测价值。TMB＆PD-L1表达或者TMB&HLA比TMB单用效果更好（Science. 2018 Feb 1;359（6375）：582-587）；亦有报道指出，某些基因突变可以作为用药敏感和用药风险的biomaker，例如B2M、JAK1/2、TP53基因突变，MDM2/4和DNMT3A基因扩增。

5.关于TMB计算，定义为体细胞非同义点突变个数/Mb；而在使用全基因组测序、全外显子组测序或者不同大小Panel的靶向NGS测序时，其计算方法并不一致，应视具体情况给出详细计算标准。

要点总结

1.高TMB与NSCLC患者PD-1联合CTLA-4阻断治疗获益相关；

2.在多变量分析中，TMB与临床的获益相关率最强；

 3.TMB和PD-L1表达是独立的预测因素；双重指标阳性患者获益最高；

4.全外显子组测序(WES)和大panel靶向NGS测序计算得到的TMB值成高度正相关。