小管形成实验 （tube formation）

       小管形成实验是测量在体外血管生成一种快速的,可量化的方法。内皮细胞结合条件培养基并接种于基底上，易形成三维网状结构。之后通过软件对小管结果进行定量分析。

   

关于内皮细胞小管形成的注意事项中。

1.一般做的多的是研究内皮细胞的小管形成。一般内皮细胞的代数不能太多，对于HUVEC的细胞系一般多采用7代以内细胞活力最好的时候用于成管试验。我们养的大鼠原代内皮细胞采用的是3代内皮细胞用于管形成的试验。如果细胞状态不佳成管肯定也形成不好。

2.基质胶。目前基质胶都采用的是BD公司的Matrigel，目前BD的基质胶被康宁收购了吧，所以现在买好像都是康宁牌的了。目前市场上基质胶也有好几种货号356234、356235 等几种。主要在于生长因子溶度上的区别。在做小管形成试验时注意选择吧。

3.关于铺胶，基质胶比较贵，一般拿96孔板铺的胶一个孔50ul左右，铺胶前可以用无血清的基础培养基对基质胶进行稀释的，我试过的比例为2倍吧。稀释太多了估计内皮细胞反而不会成管。需要注意的是96孔板底面凹凸不平本身拍照比价难聚焦，如果胶里在混入气泡图片会很难看，所以在铺胶前注意下手法最好别留下气泡。有点钱的可以试试24孔板铺胶，相对拍照的区域比较大选择的余地更多。更有钱的可以试试德国ibidi的专门做血管生成的培养皿，其底部是平的聚焦很准，拍出来的细胞肯定在一个平面上了，。感兴趣的可以试试了。具体可以参考这个帖子：

回复：ibidi血管生成实验步骤－实验方法完善版 - 丁香园论坛

4.拍照的时间点要把握好，一般内皮细胞在12h内成管吧。24h后可能管状结构趋于崩解。所以一般拍照基本会在12h内完成。具体的可以多踩点。

5.细胞数，掌握好铺板的密度，细胞密度太低难以成管，细胞密度太高也会不成管的。

6.生长因子，如果内皮细胞在胶上难以成管可以试试在培养基中加点vegf等生长因子有利于内皮细胞管状结构的形成。

7.如果需要也可以进行内皮细胞的染色如图：

8.关于管形成结果的定量分析，目前都普遍通过软件进行定量分析如IPP或image J等。

具体见

Matrigel血管生成实验的结果如何进行数据分析？ - 丁香园论坛

其中8楼为IPP软件的定量分析，帖子中有网盘下载包含血管生成分析插件的image J安装包，需要的可以自己下载。

最后总结一下血管生成的试验步骤，仅供参考用：

1。试验前一天，96孔板、基质胶、需用到的枪头（一般200ul的吧）4度进行预冷或溶解。一般基质胶如果分装的小量的话可以试验前2个小时左右开始4度溶解，可以放在冰袋上进行溶解。

2.预冷的枪头吸取50ul左右的基质胶到96孔板中，可以在冰上进行，别让基质胶受热。别有气泡。

3.96孔板放入培养箱中凝胶30min、

4.在凝胶的等待中，消化细胞制备细胞悬液，时间刚刚好，加药组可以此时与细胞共混进行处理。

5.96孔板开始添加细胞悬液，一个孔50ul的细胞悬液，同样注意别有气泡进去了。枪头别触碰到胶。

6.培养一段时间后拍照，同样可以根据需要进行calcein荧光染色。

7.拍照，图像分析。