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6月29日 Science 对“多细胞生物起源”进行了专题评论 (1) 从上到下从左到右依次为多细胞生物：拖鞋状帽贝幼虫、高冠变色龙、长鳍近海鱿鱼、片脚类动物、小鼠胚胎和矮墨鱼。胚胎染色由美国马萨诸塞州伍兹霍尔海洋生物学实验室的学生完成。 亿万年的进化岁月孕育了丰富多彩的世界，但无论生物怎么进化，万变不离其宗。从生物的角度审视，“其宗”可以指代细胞。无论是动物、植物还是微生物，都由细胞构成，细胞又由生物膜、蛋白和核酸等组成，进一步细分，这些生化分子无非由 C、H、O、N、P 等原子组成。然而时至今日，我们仍然无法回答两个基本的问题：从 0 到 1，原子是如何组装成具有自我复制能力的生命的；从 1 到 100，单细胞生物好像经历了一场“大爆炸”，单细胞生物是如何进化为拥有大量细胞（如拥有 37 万亿个细胞的人类）且细胞间相互协同的多细胞生物体。 今天我们主要探讨第二个问题：单细胞如何跨越鸿沟形成多细胞生物。此外，近些年涌现了一种具有潜力的肿瘤发生的“细胞返祖”假说，这种假说认为细胞异常地回到了原始的“单细胞”的状态是细胞癌变及肿瘤发生的原因。单细胞进化为多细胞和多细胞“返祖”为“单细胞状态”，这一正一反，如鱼之顺流和溯游，其背后的奥秘引人入胜。 化石不会说谎—多细胞生物出现的时间“证人”
根据生物所含细胞数目的多少，我们可以将其简单地划分为只有一个细胞的单细胞生物和由两个及以上细胞的多细胞生物。根据有无细胞核，细胞又可以划分为有细胞核的真核生物和无细胞核（或有拟核）的原核生物。地球现存的单细胞生物的包括原核的细菌和古细菌，以及真核的原生生物、单细胞藻类、单细胞真菌。值得一提的是，虽然仅由一个细胞组成，但是有一些单细胞生物也是肉眼可见的，比如有孔虫（Xenophyophores），它们的直径可达到 20 厘米。
单细胞生物何时进化为多细胞生物？古化石为我们提供了最直接有力的证据。单细胞生物大约出现在 39 亿年前，而多细胞生物的出现时间还存在争议。在一些化石中发现了类似微生物的群落，提示多细胞生物的出现可能追溯到 30 亿年前。
而另一些推测多细胞生物出现时间的古生物学证据 (1) 包括，在美国和亚洲发现的 20 亿年前的，呈线圈形的疑似为蓝绿藻或者绿藻的化石；一种 21 亿年前的 “卷曲藻（Grypaniaspiralis）”化石（图 1a）(2)；在南非发现的 25 亿年的微丝化石。而其他更复杂的多细胞生物在此后才涌现。此外，可追溯到 7 亿 5 千万年前的海绵被认为是最原始的多细胞动物。但是很多研究者认为，一种叶子形状的（frondlike），可追溯至 5 亿 7 千万年前的名为埃迪卡拉（Ediacarans）的生物才是第一个决定性的多细胞动物化石（图 1b）(3)。而孢子化石则表明从单细胞藻类到多细胞植物至少发生在 4 亿 7 千万年前。 图 1. 卷曲藻化石复原图（a）和埃迪卡拉化石（b）
单细胞生物如何跨越鸿沟形成多细胞生物呢？其背后的机制是怎样的呢？
如何跨越鸿沟——多细胞生物的取舍
单细胞生物孑然一身却也潇洒，一人吃饱，全家不饿，几乎没有与其他生物协作的需求。而对于多细胞生物，则需要放弃它们的独立性，坚定不移地凝聚在一起，开始执行各自特定的功能。有舍必有得，多细胞生物也获得了很多新的特性。动物获得了机动性以寻求更好的栖息地，躲避其捕食者以及追捕猎物。植物可以扎根土壤以获取水和营养物质，也可以向着阳光生长以最大化光合作用。
多细胞生物获得这些“有利特性”的遗传学基础是什么？通过比较简单的多细胞生物和它们的单细胞近亲的遗传物质，发现在进化出多细胞生物以前，有助于细胞聚集到一起而且参与协同多个细胞行为的分子装置已经预置好了。
在过去的 20 多年里，加州伯克利分校的生物学家 Nicole King一直在研究一种单细胞的原生生物——领鞭虫（choanoflagellates）。早在 2001 年，当时人们普遍认为单细胞到多细胞的进化需要跨越一个遗传学的鸿沟，而她的遗传学分析的数据质疑这种理论。
图 2. Nicole King 和她研究的领鞭虫
单细胞生物与多细胞生物共享大量的基因。她们在领鞭虫中发现了一个又一个此前被认为只在多细胞生物中发挥作用而在单细胞中不需要的基因。比如，领鞭虫拥有酪氨酸激酶基因，在多细胞生物中酪氨酸激酶参与调控特定类型细胞的功能，比如胰腺分泌胰岛素的功能；它们还有细胞生长的调控因子，如与人类肿瘤密切相关的抑癌基因 p53；此外，领鞭虫还有钙粘素和 C-型凝集素，这些因子可以帮助细胞聚集在一起，维持组织完整。通过在 21 种领鞭虫中系统地研究了其活性基因，Nicole King 实验室发现这些简单的生物中拥有大约 350 个基因家族，这些基因之前被认为只在多细胞动物中表达 (4)。 这些基因的原始版本可能与它们此后执行的功能不同。比如，领鞭虫中也有对神经元非常关键的蛋白基因，但是领鞭虫与神经元并没有什么相似性。类似地，它们的鞭毛中有一种蛋白，在脊椎动物中，这种蛋白帮助建立身体的左右对称性，但是其在领鞭虫中的功能并不清楚。需要注意的是，领鞭虫的基因组并不参与多细胞特性的每一方面，它们确实缺少一些关键的基因，包括转录因子基因 Pax 和 Sox，它们对于动物的发育十分关键。
当细胞聚集到一起的时候，它们不仅仅把已经存在的基因赋予新的功能，在团藻中的研究发现，多细胞生物还会对已经存在的功能赋予新的应用场景。团藻（Volvox）拥有大约 500~60000 个细胞，排列成中空的圆形。而它们的近亲，比如性原细胞，只有很少的细胞（4~16 个），而其他的一些则完全是单细胞。通过比较单细胞和拥有数千细胞的生物的遗传学特征，生物学家们开始收集生物变得更复杂所需的条件。这些研究告诉我们，在复杂的多细胞生物中，特化细胞的很多功能并不是新的。相反，在单细胞生物中看见的特征和功能在它们的多细胞亲戚中以时间和空间特异性的方式被重新排列。
图 3. 多细胞的团藻和它的单细胞近亲衣藻
比如，在团藻的单细胞近亲衣藻（Chlamydomonas）中，中心粒身兼两职。在细胞生命周期的大部分时间，它们负责锚定两个鞭毛，驱使细胞在水中游动；但是当细胞开始繁殖时，它丢失了鞭毛，中心粒朝两个核移动，在那里负责拉开染色体。复制完成后，子细胞重新长出鞭毛。衣藻既可以游动，也可以繁殖，但是在不同的时间点进行；而由于多细胞生物的细胞是特化的，因此团藻可以同时执行这两种功能。具体而言，团藻中更小的细胞一直有鞭毛，可以帮助其游动；更大的细胞缺少鞭毛，则利用中心粒进行细胞分裂。
团藻也可以再利用单细胞祖先中的其他特性。在夜间，光合作用关闭而且能源稀少，衣藻中一种古老的应激响应通路阻断了其繁殖。但是在团藻的游动的细胞中，这个通路一直是激活的，以维持其繁殖能力。在进化过程中，单细胞祖先增加了对环境信号的响应，以促进其复杂的多细胞后裔中的劳动分工。 在过去的十多年里，西班牙的进化生物学家 Ruiz-Trillo 和他的同事比较了很多原生生物与动物的基因组，这种比较揭示了动物基因组具有更大的尺寸和更高的复杂性。但是一个更加有意思的发现是，当 Ruiz-Trillo 等分析了原生生物荚膜菌（Capsaspora）的基因调控信号网络时，他们发现在特定的情况下，原生生物使用跟动物同样的转录因子和长链非编码 RNA 来打开或者关闭基因，但是基因的启动子比动物中的更短，而且更加简单，这提示单细胞生物中的基因调控更加简单 (5)。Ruiz-Trillo 团队认为，多细胞形成的关键是基因调控的精细程度提升了。如果只是部分遗传开关的重置，使得现存的基因在新的时间和地点激活，那么从单细胞到多细胞生物的巨大鸿沟看起来并不那么令人望而却步。
雪花细胞，实验室里的细胞飞跃
2009 年 12 月的一天，美国明尼苏达大学的进化生物学家 Michael Travisano 和他博士后 William Ratcliff（如今为佐治亚理工的助理教授）正在就今后实验室该做什么而激烈辩论。当时他们正好听完一个关于阿米巴菌的报告：在特定的条件下，一些单细胞的阿米巴可以联结成百万细胞的团体，并且以一种协同的方式工作，就好像是整个生物一样 (6)。
图 4. William Ratcliff（左）和Michael Travisano（右）
受到这项工作的启发，Travisano 和 Ratcliff 开始认真地考虑单细胞生物进化为多细胞生物背后的奥秘。通常的做法是分析化石记录或者比较已经存在的生物的基因组，但是他们却另辟蹊径，他们决定尝试强迫酵母定向进化。其实长期以来，人类已经进行了各种非自然的选择了，基于人类的需求修改并获得了很多物种，比如瘦肉猪、抗旱植物、可以产生化学物质的细菌等。Travisano 和 Ratcliff 希望在可控的条件下，强迫单细胞向多细胞进化。
具体的做法是，采用单细胞生物酵母进行人为的定向筛选，只让那些最大的细胞（通过测量它们沉降到试管底部的速度，越大的细胞，沉降到底部越快）生存和繁殖。结果十分惊人，60 天就出现了多细胞簇。确切地说，新生的细胞与老的细胞聚集在一起形成了一种分支结构，看起来像雪花（snowflake）(7)。
图 5. 雪花状的多细胞簇 (7)
随着单细胞都开始进化（其中的一些甚至已经经历了 3000 代），雪花开始变大，酵母细胞变得更加耐受和伸展，而且进化出了一种新的繁殖模式。在大的雪花酵母中，沿着分支的少数细胞经历了自杀，释放了处于顶端的细胞，进而开始形成新的雪花。部分细胞牺牲自己以实现整体的繁殖，这是细胞分化的初始形式。这背后的遗传学基础可能是已经存在的基因为了新的功能而被激活，或者另一些基因，比如有助于酵母分离的基因，变得沉默。
人一多就容易乱，对雪花酵母也是。因此雪花酵母也进化出了一种保卫机制，对于多细胞的形成十分关键，而且可以隔绝细胞中的异己。当突变让一些细胞与其他细胞不同时，叛徒就会产生。在复杂的多细胞生物（比如人类）中，保护机制部分来源于免疫系统，可以摧毁异常的细胞；雪花酵母也有清除异己的能力。突变会随着时间而聚集，因此大多数异常的细胞出现在雪花的顶端，但是在他们有机会变成叛徒之前通常会断裂形成新的克隆。
图 6. 雪花酵母的形成机制 (1)
在酵母中这种机制也有助于集体性状的进化。每个雪花分支中释放的细胞的突变会传递到下一个克隆的所有细胞中。结果，接下来的雪花开始了新的集体性状，在尺寸和细胞数目上或者自杀细胞的频率和位置上呈现出差异。从那个时间点算起，这就是以细胞聚集体而不是单一个体为单位在适应环境。
酵母的结果并不是个案。在 2014 年，Ratcliff 和同事们在更大的衣藻细胞中执行相同的定向选择条件，再次看到了克隆的迅速合并。但人们质疑，实验条件下的人为筛选是非自然的，并不能很好地模拟现实环境因而其现实意义有限，为了回应这种质疑，Ratcliff 和同事 Herron 随后利用一种更加自然的筛选压力重复了衣藻的实验。自然选择的实验采用了一种吃衣藻的草履虫，它们倾向于吃掉更小的细胞而保留更大的细胞。实验再次显示，在 750 代以内（大约需要一年时间），五个实验群体中的两个都开始形成群体并以群体形式繁殖 (8)。 数十亿年的进化压力终于造就了多细胞生物，如鱼儿经历千难万险终于抵达大海，但是有一天，它们却突然溯游而上，心中有光，朝着来的方向。
细胞溯源，肿瘤之源？
当多细胞生物中的一些细胞忘记自己的属性，回到“单细胞状态”时，多细胞生物可能发生意想不到的紊乱。近些年来，科学家们正在尝试用细胞的“返祖”行为来解释肿瘤的形成机制。
肿瘤的返祖理论（atavistic theory of cancer）认为，细胞从“多细胞状态”回到“单细胞状态”是细胞癌变和肿瘤形成的关键原因 (9)。为了验证这个理论，计算生物学家开发了一种名为“基因组进化年龄层学（genomic phylostratigraphy）”的方法 (10, 11)。澳大利亚的计算癌症生物学家 David Goode 和同事们利用这种方法，将基因划分到 16 个系统发育年龄层（phylostrata），然后比较正常组织和七种实体瘤（括乳腺癌、肺癌、肝癌等）中的基因表达。结果显示，相比于正常组织，肿瘤过表达在进化上更加古老的基因（来自前两个系统发育年龄层），而通常不表达在进化上更年轻的基因（来自 3~12 系统发育年龄层）。这些结果说明肿瘤细胞好像回到了“远古时代”，表达更“远古的基因”，这为肿瘤的返祖理论提供了有力的证据(12)。
当单细胞生物跨越到多细胞生物，它必须进化基因调控网络，以保证细胞在合适的时间停止分裂，而且与周围的邻居和谐共处。Goode 及其同事提出，在癌症中，那些可以摧毁基因调控网络的突变使得进化过程中形成的限制（比如生长限制）被解除，使那些适应单细胞生活状态的基因恢复自由，驱使细胞生长。肿瘤似乎解除了进化为多细胞生命所必须的分子限制 (14)。
未解决的问题
上面我们提到了，在两个月时间内就在体外获得雪花状的多细胞簇，至少说明跨越单细胞到多细胞的鸿沟并不像我们现象的那么困难。如果多细胞形成如此简单，为何自然进化过程花了数十亿年？传统观点认为，这主要归因于早期大气中的低氧。为了获得足够的氧气，生物需要最大的比表面积（面积/体积），这种对氧气的需求迫使它们保持很小的体积。只有当 10 亿年后，氧气的浓度上升了，更大的多细胞生物才会出现。
2015 年，剑桥大学的古生物学家 Nicholas Butterfield 提出，低氧其实更有利于远古的海洋生物向多细胞生物进化。更大的多细胞生物具有很多鞭毛，更加擅长将细胞表面的水清除掉以获取更多的氧气。远古海洋中贫乏的营养物质帮助驱使了下一步——特定细胞类型的进化，因为更加复杂的生物可以更加高效地获取食物。但是至于为什么复杂的生物需要如此长的进化时间，Butterfield 认为这个鸿沟反映了进化出更加复杂的基因调控网络所需要的时间。
一旦生物跨域了到多细胞生物的瓶颈，他们很少再回来。在很多谱系中，细胞和器官类型的数目不断增加，进化为更加复杂的方式以协调他们的活动。Ratcliff 和瑞典理论生物学家 Eric Libby 在四年前提出棘轮效应（ratcheting effect）会驱使生物复杂度的增加 (15)。当细胞变得越来越复杂，而且越来愈依赖于其他细胞的时候，回到单细胞的生活方式就越困难。牛津大学的进化生物学家 Guy Cooper 和 Stuart West 近期用数学模拟法验证了这个设想 (16)。他们的结果显示，劳动力的分工并不是结果，而是原因。既然如此，为何在肿瘤细胞中，我们依然能够发现细胞的“返祖”现象？究竟是什么驱动了细胞的“返祖”？细胞“返祖”一定会导致肿瘤发生吗？
此外生物体中其实经常发生从单细胞到多细胞的过程，比如胚胎的发育，人类胚胎经过 10 个月就会产生个体，这种细胞的“干性”或者“分化潜能”与单细胞进化为多细胞生物具有怎样的关系？是否可用类似的理论来解释？从进化的角度出发，进一步剖析单细胞到多细胞的进化过程以及细胞的“返祖”的机制将加深我们对于干细胞分化和肿瘤形成的认识，我们寄希望于根据这些新理论开发新的疾病治疗方法。 写到这里，我不禁想起此前庄小威在她的报告中说到这样一段话：越小的东西，你会认为越难理解，但是的确在生物里面，原子水平我们理解的相对多一些，分子水平相对少一些，细胞水平更少一些。人体的 37 万亿个细胞间如何协同工作，等待着我们一代又一代人去探索。
参考文献： 1. Pennisi E. The power of many. Science. 2018;360(6396):1388-91. 2. El Albani A, Bengtson S, Canfield DE, Bekker A, Macchiarelli R, Mazurier A, et al. Large colonial organisms with coordinated growth in oxygenated environments 2.1 Gyr ago. Nature. 2010;466(7302):100. 3. McMenamin MA. The garden of Ediacara: discovering the first complex life: Columbia University Press; 2000. 4. Richter DJ, Fozouni P, Eisen MB, King N.Gene family innovation, conservation and loss on the animal stem lineage.eLife. 2018;7. 5. Sebé-Pedrós A, Ballaré C, Parra-Acero H, Chiva C, Tena JJ, Sabidó E, et al. The dynamic regulatory genome of Capsasporaand the origin of animal multicellularity. Cell. 2016;165(5):1224-37. 6. Pennisi E. Evolutionary time travel.American Association for the Advancement of Science; 2011. 7. Ratcliff WC, Denison RF, Borrello M, Travisano M. Experimental evolution of multicellularity. Proceedings of theNational Academy of Sciences. 2012;109(5):1595-600. 8. Herron MD, Borin JM, Boswell JC, Walker J, Knox CA, Boyd M, et al. De novo origin of multicellularity in response to predation. bioRxiv. 2018:247361. 9. Bussey KJ, Cisneros LH, Lineweaver CH, Davies PCW. Ancestral gene regulatory networks drive cancer. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America.2017;114(24):6160-2. 10. Domazet-Loso T, Brajkovic J, Tautz D. Aphylostratigraphy approach to uncover the genomic history of major adaptations in metazoan lineages. Trends in genetics: TIG. 2007;23(11):533-9. 11. Domazet-Loso T, Tautz D. Phylostratigraphictracking of cancer genes suggests a link to the emergence of multicellularity in metazoa. BMC Biol. 2010;8:66. 12. Trigos AS, Pearson RB, Papenfuss AT, Goode DL. Altered interactions between unicellular and multicellular genes drive hallmarks of transformation in a diverse range of solid tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2017;114(24):6406-11. 13. 吕宝忠. 奠基者基因的进化年龄及其意义.自然杂志. 2011;33(5):271-4. 14. Pennisi E. Is cancer a breakdown of multicellularity? Science. 2018;360(6396):1391. 15. Libby E, Ratcliff WC. Ratcheting the evolution of multicellularity. Science. 2014;346(6208):426-7. 16. Cooper GA, West SA. Division of labour and the evolution of extreme specialization. Nature ecology & evolution.2018:1. |
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