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RNAseq看表达量高低是看哪个值?

2018-07-17  wangprinc...

RNAseq看表达量高低是看哪个值?

1.Read count
数值概念:比对到gene Areads数。

用途:用于换算CPMRPKM等后续其他指标;作为基因表达差异分析的输入数值。
大部分差异分析软件(如DESeqedgeR,用原始的可比对的reads count作为输入,并用负二项分布模型估算样本间基因差异表达的概率

软件自动会对reads count做一些校正。如果你使用一些校正后的指标,例如RPKM作为输入,是不合理的。


2.CPM
Counts per million
数值概念:计算公式:CPM=C/N*1000000

C为比对到 gene A reads 数(read count),

N 为比对到所有 gene 的总reads 数。

用途:在某些情况下,只想了解每个基因被覆盖到的相对reads数,而不希望对其做长度校正,就会使用这个指标。

在某些RNA-seq文章或一些软件输出结果中(如edgeR)会出现。


CPM
只对read count相对总reads数做了数量的均一化。当如果想进行表达量的基因间比较,则不得不考虑基因长度的不同。如果进一步做长度的均一化,就得到了下面的RPKM

3.RPKM
Reads Per kb perMillion reads

数值概念:计算公式:RPKM=(1000000*C)/(N*L/1000)
C 为比对到 gene A reads数(read count),N为比对到所有 gene 的总 reads 数,L gene A 的碱基数。
RPKM
法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响,计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。

用途:用于与基因表达量相关的后期分析。例如:基因表达趋势分析、共表达网络构建,热图绘制等都使用这类数值。 FPKM意义与RPKM极为相近。二者区别仅在于,Fragment ReadRPKM的诞生是针对早期的SE测序,FPKM则是在PE测序上对RPKM的校正。只要明确ReadsFragments的区别,RPKMFPKM的概念便易于区分。Reads即是指下机后fastq数据中的每一条ReadsFragments则是指每一段用于测序的核酸片段。

 

 

 

RNA是单链分子,RNA主要有三种 :

信使RNAmRNA- 转录遗传信息

核糖体RNArRNA蛋白质合成

转移RNAtRNA- 运载氨基酸

核糖体是蛋白质合成的场所,核糖体主要由蛋白质分子和rRNA组成

 

rRNA mRNA tRNA

 

 

 

 

1.RNA-Seq又称转录组高通量测序(transcriptome sequencing)或称为全转录组鸟枪法测序(Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS)

把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成的 cDNA 上,

从而获得来自不同基因的RNA 片段在特定样本中的含量

 

2.基因表达(gene expression

基因组中结构基因经过转录、翻译等过程,合成蛋白质,进而发挥其特定的生物学功能的全过程。

 

3.转录组

遗传学中心法则表明,遗传信息通过信使RNA(mRNA)DNA传递到蛋白质,

因此,mRNA被称为DNA和蛋白质之间信息传递的桥梁”,而所有表达基因的序列及其转录水平,综合起来被称为 转录组(transcriptome)

:特定组织或细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,包括mRNA和非编码RNA

转录组(transcriptome

广义上指某一生理条件下,细胞内所有转录产物的集合,

包括信使mRNA核糖体rRNA转运tRNA非编码non-coding RNA

狭义上指所有mRNA的集合。

蛋白质是行使细胞功能的主要承担者,蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述,转录组成为研究基因表达的主要手段,转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带,转录水平的调控是目前研究最多的,也是生物体最重要的调控方式。 

 

基因的Transcript Variant isoform的区别如下:

 

1.  transcript variant是从结果来看的,一个基因产生了不同的mRNAsplice variant是从过程讲的,强调内含子剪切的方式不一样。

2.  variant指的是转录本的亚型

isform指的是蛋白水平的。

有的时候虽然variant很多但是对应的蛋白可能是重复的。

 

3.  有很多过程可以影响isoform的形成,如可变剪切,即不一定所有的外显子都用来形成成熟的mRNA,而且有时候什么内含子外显子也不是绝对的。

另外有RNA editing这个过程,会使得形成mRNA时某个特定的位置的碱基发生变化,也就是变成不是原来基因想要编码的东西。

 

4.  有个例子就是一个叫XBP-1转录因子,它调控细胞的unfolded protein response,激活方式就是上游蛋白剪切其mRNA然后生成有活性的mRNA,所以这种variant的生成竟然也是调控的一种方法。

 

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