二甲双胍又双叒叕出来搞事情啦，还不快来看看！

因为懒，所以一直拖、拖、拖，所以，这篇推文就难产了，不过还好，经过我自己不断地催促，最终还是写完了，没有让它胎死腹中。而且到现在也一个多月没发推文了，是时候再发一篇了。

二甲双胍，一种耳熟能详的治疗二型糖尿病的药物，具有很好的降糖效果，发挥降糖作用的主要机制是激活细胞内的AMPK通路（也是本文研究的主要通路）。但它的作用又不仅仅是可以治疗糖尿病，近年来，在抗癌、抗炎、抗衰老、减肥、心血管保护、治疗多囊卵巢综合症等领域都可以见到它的身影，可谓是“神药”，而且其价格便宜、副作用小，实为居家必备之良药（不过如果要服用，还是得听从医生建议哦）。

Metformin reverses established lung fibrosis in a bleomycin model

首先我们来看一下这项研究的核心要点：

1、科学假设：二甲双胍可以通过激活AMPK通路逆转肺纤维化

2、研究内容：肺纤维化区域内AMPK通路活性有何变化？AMPK激活对于肺纤维化表型有何影响？AMPK的激活在二甲双胍逆转肺纤维化过程中是否是必要的？

3、研究结论：二甲双胍可以激活肺纤维化区域细胞内AMPK通路，一方面可以调节细胞外基质蛋白的稳态，减少积累，另一方面可以促进细胞内线粒体的发生，重建肌成纤维细胞对凋亡的敏感性，从而逆转肺纤维化。

先来了解一下什么是肺纤维化：肺纤维化是以肺内成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常（疤痕形成）。导致肺纤维化的因素众多，如感染、放疗、化疗（本文中的肺纤维化动物模型即为化疗药物博来霉素诱导而来）等。但大多数肺纤维化病因不明，特发性肺纤维化（IPF）就是其中一类，它是一种慢性、进行性，最终致命的纤维化肺疾病，好发于老年人，且目前没有有效治疗药物。因此，如果能找到一种可以改善肺纤维化进程的药物，对于病人来说将是一大福音。

好，接下来就让我们一起来看看作者是怎么进行的研究吧！

作者首先进行的是AMPK功能表型探究，作者为什么选择AMPK通路进行研究？因为AMPK在纤维化过程中的作用尚不完全清楚，所以就关注了它。首先，作者收集了健康人和IPF患者的肺组织标本，通过检测发现，与正常相比，肺纤维化区域内AMPK活性显著降低而α‑SMA（表达量与纤维化程度呈正相关）表达量显著上升，且细胞自噬受到了抑制（LC3BⅡ表达量降低）。有了这些结果，说明观察到了表达差异，那么在接下来的研究中，AMPK就可以作为一个操纵的变量，而α-SMA等差异分子就可以作为一个反映纤维化程度的一个指标。【Figure1 & SFigure3】

Figure1 & SFigure3

如前所述，作者接下来就开始使用AMPK的激活剂AICAR进行干预，发现AMPK被激活后，细胞外基质蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、α‑SMA均有所减少，自噬现象增加，这些结果说明了纤维化程度降低，表明了激活AMPK有了效果，选择AMPK进行研究是正确的方向。【Figure1】

Figure1

TGF‑β1 的是纤维化过程中的一个关键分子，可以促进纤维化进程。以前的研究观察到了二甲双胍的抗纤维化作用可能是由于干扰了TGF‑β1信号通路，但AMPK是否在其中起作用却不得而知。为了探究这一点，作者做了以下验证：操纵AMPK分子，控制其表达与否，在这两种情况下，用TGF‑β1诱导的同时加入AICAR，观察所产生的效应，发现，当AMPK基因没有被敲减时，纤维化相关指标会降低，然而在AMPK基因被敲减之后，AICAR就不起作用了，使用二甲双胍代替AICAR可以观察到同样的效应。通过这两步操作，就可以证明了AMPK的激活在降低纤维化过程中所起到的作用。【Figure2】

Figure2

纤维化的发生是因为细胞分泌了过多物质沉积在细胞外基质，TGF‑β1可以促进细胞外基质中物质（如胶原纤维等）的积累，而自噬是细胞清除多余物质的一条重要途径。因为AMPK可以激活细胞自噬，所以接下来作者就探究了AMPK激活的自噬是否可以促进过多细胞外基质的清除。首先作者加入氯喹抑制自噬的晚期阶段（late autophagy），发现细胞内有胶原的积累，也即清除受阻。然后又聚焦到一些自噬上游关键分子并阻断它们，同样发现当自噬被抑制后，AICAR抑制TGF‑β1（TGF‑β1诱导胶原积累）的作用消失了，以上结果说明了：AMPK激活的自噬控制着胶原的清除，防止了其在细胞外基质中的积累，也即调节了细胞外基质的稳态。【Figure2】

Figure2

另一方面，AMPK失活可导致线粒体功能障碍和代谢重编程，而这些又是调节纤维母细胞向肌成纤维细胞（在纤维化中起重要作用）分化及其功能重要因素。电镜观察显示，IPF患者肺纤维化区域内的肌成纤维细胞内可见线粒体碎片，这可能是由于受损线粒体清除缺陷所致，为什么会不能清除？因为自噬受阻。同时，因为线粒体功能受损，伴随着活性氧的产生增加，进一步增加组织损伤。对AMPK缺陷的纤维母细胞进行生物能量学分析，发现基础氧耗、ATP相关氧耗、呼吸峰值、线粒体储备均降低，再一次印证了AMPK失活后线粒体功能的受损，而且其中调节线粒体自噬的关键因子——S555-ULK1磷酸化也发生了下调，即细胞自噬水平降低。【Figure3】

Figure3

已经发现，线粒体是细胞程序性死亡（细胞凋亡）的调节器和效应器，在癌细胞中，线粒体受损后，细胞对于有氧糖酵解的重编程是细胞抵抗凋亡的关键因素。然而目前关于IPF中肌成纤维细胞如何获得抵抗凋亡能力的机制还不清楚，已有的研究表明TGF‑β1起到了一定的作用。在此项研究中，作者发现AMPK激活可以逆转肌成纤维细胞获得的凋亡抵抗，使其对凋亡反应更加敏感；而当AMPK表达沉默之后，上述效应就消失了。为什么？作者提出了其假设：肌成纤维细胞恢复对凋亡的敏感性可能是由于增强了的细胞内线粒体的发生（mitochondrial bioenergetics）。然后作者就进行了实验验证，结果发现无论使用二甲双胍还是AICAR，都可以见到促进作用（TFAM及线粒体呼吸链组分表达升高等）【Figure3】。

Figure3

到这里，本文所要解释的分子机制也都出来了：AMPK激活一方面可以调节细胞外基质的稳态，另一方面可以促进线粒体发生，重建肌成纤维细胞对于凋亡的敏感性。最难的部分已经过去，但只有这些够不够呢？显然是不够的，因为做了这么多，都还只是离体试验，说好的先细胞再动物，没有动物实验怎么又说服力呢？所以，接下来还要再进行在体验证。

作者先用博来霉素诱导建立了肺纤维化小鼠模型，之后的组织染色观察到了纤维化区域内AMPK活性降低，发现连续18天的隔日腹腔注射二甲双胍很明显地增加了线粒体发生和AMPK活性，降低了肺纤维化标志物，包括肺内羟脯氨酸、α-SMA等。为了验证AMPK激活在此过程中的必要性，作者做了转基因动物模型——敲除AMPK基因，结果发现二甲双胍的上述效应消失，这些步骤的动物实验验证，使上述得到的分子机制结论更具有说服力。

最后附上一张本文分子机制图，好的，本次文献讲解到此结束，下次再见！