肿瘤微环境中的基质细胞蛋白POSTN对肿瘤异质性的影响

昵称32772025 2018-07-20

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广义而言，肿瘤异质性可分为肿瘤间异质性和肿瘤内异质性两类，其中前者指的是不同肿瘤的细胞之间的基因与表型不同，后者指的是相同肿瘤的不同细胞之间的基因与表型不同。在此，若无特别提及的话，谈及的肿瘤异质性指的是肿瘤内异质性。

肿瘤的异质性是恶性肿瘤的特征之一，是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。肿瘤异质性可粗略地分为时间异质性、空间异质性、结构异质性、细胞异质性、蛋白异质性、基因异质性和功能异质性等。空间异质性常表现为下述三种情况：在未扩增的细胞背景中有成簇扩增细胞；少量扩增背景中有未扩增的细胞；孤立的细胞扩增。空间异质性表现为免疫组织化学和荧光原位杂交结果不一致或者同一组织中癌基因扩增结果不一致。时间异质性表现为癌基因扩增在浸润性乳腺癌及转移癌中提示预后不良，而在早期原位癌中没有预后价值。2013年，Kreso等发现后代肿瘤细胞虽然具有相同基因组变异，但它们的增殖能力和对化疗药物的敏感性，表现出显著的不一致。由此可见，肿瘤细胞还存在功能异质性。

1976年，Peter Nowell提出肿瘤异质性起源的“克隆演化”理论（如图1所示），认为连续多轮克隆选择是导致肿瘤基因及其他分子变异的根本原因。“克隆”是指无性繁殖，克隆演化只涉及体细胞，不涉及性细胞。不过近年来，科学家陆续提出肿瘤含有少量肿瘤干细胞，肿瘤干细胞是肿瘤发生的“罪魁祸首”（如图2所示）。如果不清除肿瘤干细胞，即便通过放疗或化疗消灭了大部分肿瘤细胞，最终还是因肿瘤干细胞分化产生导致肿瘤复发和转移，并对放疗或化疗产生耐药性。其实不论是克隆演化理论，还是肿瘤干细胞理论，肿瘤异质性产生的本质也就在于 “外因”（环境）对“内因”（基因）的双重作用。除极个别情况外，肿瘤发生通常只涉及体细胞而不涉及性细胞。因此，人体的绝大多数肿瘤都不会遗传给后代，但种系基因缺陷所致肿瘤遗传倾向例外。

图1.克隆进化理论，图片来自Lcchong/Wikipedia。

图2.肿瘤干细胞理论，图片来自Lcchong/Wikipedia。

一旦肿瘤产生，现在的说法是基因组不稳定性导致的，也就是肿瘤既可能源于遗传上的基因突变，也可能源于表观遗传上的基因修饰（如甲基化、乙酰化等）。而无论是良性肿瘤还是恶性肿瘤都存在各种基因突变或DNA甲基化修饰。

肿瘤异质性来自环境因素分布及作用的不均一性与基因突变的随机性。正是因为有环境因素不均一性的存在，所以才会有肿瘤微环境的说法。基因突变的随机性一方面体现在突变位点的多样性上，另一方面也体现在突变后是否致瘤上。一个细胞的基因突变可致癌，而另一个细胞的基因突变后却不致癌。

肿瘤微环境是由肿瘤细胞、基质细胞和胞外基质（ECM）共同组成，能够促进肿瘤进展，增加肿瘤浸润性，躲避宿主免疫反应和促进对治疗产生抵抗性。基质细胞是肿瘤微环境中的重要组成部分，包括肿瘤周围的浸润免疫细胞、新生血管及其内皮细胞、间充质干细胞、肿瘤相关成纤维细胞（CAF）等，如图3所示。

图3. 肿瘤微环境中的各种细胞类型，图片来自Melissa R. Junttila et al, Nature, 19 September 2013, 501:346–354, doi:10.1038/nature12626。

肿瘤微环境中的免疫细胞通常包括肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)、调节性T细胞（Treg）、自然杀伤细胞（natural killer cell, NK细胞）、巨噬细胞、树突细胞和骨髓来源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSC）等。研究证实肿瘤患者中免疫细胞大多失调和受损，而免疫功能受抑制有利于肿瘤细胞生存及发展。

在肿瘤微环境中，肿瘤细胞利用PD-1及其配体PD-L1、CTLA-4、LAG-3、Tim-3和CD160等抑制性信号通路使得TIL的功能受到抑制，造成肿瘤免疫抑制。它们向肿瘤微环境分泌TGF-β、IL-2、IL-10、VEGF、MMP等免疫抑制性因子抑制免疫细胞的抗肿瘤作用。它们还低表达或不表达MHC-1等表面抗原，阻止周围的T细胞等免疫细胞活化。此外，肿瘤保持较高的糖酵解途径，消耗更多的葡萄糖，产生更多的乳酸，从而使得肿瘤微环境中的氧气、营养物缺乏和酸性物质堆积，抑制T细胞等免疫细胞的生长，甚至促进T细胞死亡。

肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤基质中最常见、比例最大的的细胞组分，对肿瘤微环境的形成是至关重要的。在肿瘤早期形成过程中，肿瘤细胞分泌的IL-6和IL-8等趋化因子使得肿瘤周围正常的成纤维细胞转化为CAF。CAF会选择性表达具有FAPα，并且在FAPα的作用下形成适宜肿瘤细胞恶性增殖和转移的微环境。

在肿瘤组织中，HIF等多种转录因子可触发VEGF等促血管生成因子的表达，导致肿瘤微血管密度异常增加、血管壁结构不完整和功能异常。血管壁结构不完整使得局部血液外漏，造成肿瘤组织间质液压（IFP）升高。这最终形成一种低氧、低pH和高IFP的恶性肿瘤微环境。低氧可通过促进促血管生长因子和HIF-1α表达来促进血管形成，诱导肿瘤细胞发生上皮-间质转化，促进它们转移。低pH的酸性微环境能够通过促进IL-2的产生而加速Treg的分化、MDSC的产生、抑制TIL的肿瘤浸润并诱导TIL凋亡，此外还促进肿瘤相关巨噬细胞分泌大量细胞因子促进肿瘤血管形成。高IFP能够阻止免疫效应细胞到达肿瘤组织和干扰药物在肿瘤细胞中的分布和扩散。此外，高IFP导致肿瘤中心和外围压力差过大，从而促进肿瘤细胞进入淋巴管。

图4.在肿瘤微环境中，免疫细胞与其他基质细胞之间的交谈，图片来自Shannon J. Turley et al. Nature Reviews Immunology, 2015, 15:669–682, doi:10.1038/nri3902。

总之，肿瘤细胞微环境之间的相互作用和联系是双向的，主要是通过一个复杂的免疫因子网络，如细胞因子、趋化因子、许多生长因子和基质细胞蛋白，如图4所示。肿瘤微环境中的一些重要免疫因子的异质性可导致肿瘤预后的多样性。如肿瘤微环境中的抑制性细胞因子IL-10，TGF-β，IL-8，IL-17和趋化因子CXCL12的浓度与肿瘤不良预后成正比。此外，IL-2、IL-6、TNF-α、IL-12、IFN-γ、HLA-DR和IL-23等促炎细胞因子可促进相关免疫细胞的招募和增殖，从而获得抗肿瘤作用并延长总生存率。IL-27在肿瘤微环境中发挥肿瘤杀伤和免疫抑制的双刃剑作用，一方面IL-27在肿瘤微环境中通过调节NK细胞和自然杀伤T细胞的招募和激活抑制肿瘤生长，另一方面还可通过调节Treg的迁移促进肿瘤生长。TGF-β是一种多功能细胞因子，可调节细胞增殖、分化、免疫抑制活性的转移。TGF-β抑制促炎细胞因子的产生，如IL-12，IL-2和IFN-γ，上调IL-10。

基质细胞蛋白一组非结构性胞外基质蛋白，包括血小板反应蛋白（TSP）、骨粘连蛋白（ON）、蛋白CCN、肌腱蛋白（TN）、骨桥蛋白（OPN）、骨膜蛋白（periostin, POSTN）和蛋白TGFBI等。它们通常在大多数成体组织中低水平存在，但在成年有机体的损伤或炎症部位中高度表达。它们通过结合其他的胞外基质蛋白结合来重塑组织微环境，通过结合生长因子和细胞因子来调节它们的活性，并通过与细胞膜中的特异性受体相互作用来调节细胞内的信号转导，从而发挥多种功能。越来越多的证据表明，它们在炎症反应和肿瘤发展中起着重要的作用，如图5所示。

图5.肿瘤休眠与基质细胞蛋白，图片来自Tiantian Wu et al. Protein Cell, April 2014, 5(4):249–252, doi:10.1007/s13238-014-0023-6。

当前在动物模型和患者中的研究已表明骨膜蛋白不仅参与包括纤维化、关节炎、动脉粥样硬化和其他炎症性疾病在内的各种疾病的病理生物学，而且也参与肿瘤发生和转移。

近年来，针对作为一种基质细胞蛋白的骨膜蛋白在异质性的肿瘤微环境中的功能方面的研究取得不断进展。

POSTN是最近发现的一种基质细胞蛋白，在人类中由POSTN基因编码，作为配体与alpha-V/beta-3和alpha-V/beta-5整合素相互作用，支持上皮细胞的粘附和迁移的蛋白质。它在骨外膜、软骨膜、牙周膜、肌肉筋膜、软骨关节面和关节韧带中高表达，因而在骨骼发育、组织修复、心血管系统和呼吸系统中发挥作用。此外，它在炎症和多种癌症中也表达，促进结肠癌和乳腺癌等多种癌症转移。

我国厦门大学生命科学学院/细胞应激生物学国家重点实验室教授、博士生导师、生命科学学院副院长、中国细胞生物学学会理事欧阳高亮课题组长期致力于研究基质蛋白（如POSTN、OPN等）在肿瘤转移中的功能，发现这些蛋白可通过促进细胞生存、上皮细胞间质转化、干细胞干性维持和血管发生来促进肿瘤转移。欧阳高亮课题组的研究表明骨膜蛋白和OPN等细胞基质蛋白在炎症发生和肿瘤转移过程中可参与重塑组织微环境。从2004年起，欧阳高亮课题组先后在Cancer Cell、Cancer Letters、Cellular and Molecular Life Sciences、Cell Stem Cell、 PLoS ONE、Matrix Biology、Cell Metabolism、 Protein Cell、American Journal of Pathology和Journal of Hepatology等知名的期刊上发表十几篇针对POSTN蛋白在炎症性疾病和癌症中的功能的文章。

2014年7月，欧阳高亮课题组在Matrix Biology期刊上发表了一篇综述文章，指出作为一种至为重要的发育因子和分泌的胞外基质蛋白，POSTN不仅参与炎症性疾病，而且还积极地促进肿瘤发生和转移。POSTN和/或它的mRNA高表达在大多数实体瘤中检测到，包括乳腺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳头状甲状腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌和神经母细胞瘤。

在结肠癌和卵巢癌中，POSTN通过αvβ3和/或αvβ5受体相互作用增加细胞运动和存活，从而发挥它的促转移作用。

作为一种细胞粘附分子，POSTN促进肿瘤微环境中的浸润，导致食管癌出现新的肿瘤浸润性特征，而且对POSTN表达的诱导依赖于EGFR信号转导和突变型p53。胰腺癌中的POSTN mRNA水平是非常高的。胰腺星状细胞能够被一种自分泌POSTN环和过量产生的胞外基质蛋白激活，从而产生一种支持肿瘤生长的微环境。对POSTN表达的诱导产生过量的胞外基质蛋白，包括1型胶原蛋白和纤连蛋白，从而促进肿瘤在营养缺乏、低氧和化学治疗压力下生长。在胰腺导管腺癌中，血清POSTN水平上升了。促结缔组织增生性基质（desmoplastic stroma）分泌的POSTN蛋白通过β4整合素-FAK信号通路增强浸润性，并且通过激活PI3K/Akt通路促进胰腺腺癌细胞在低氧条件下存活。POSTN水平在人乳腺癌中也上升了，特别是在发生骨转移或淋巴转移的乳腺癌患者中。POSTN在人乳腺癌中的过表达通过FAK介导的信号通路诱导血管生成。再者，POSTN可起着乳腺瘤肺转移的一种限制因子的作用。POSTN招募Wnt配体来增强乳腺癌干细胞中的Wnt信号，因而促进细胞自我更新和转移形成。POSTN促进口腔鳞状细胞癌中的浸润和血管生成，并可作为口腔癌患者中的一种转移标志物。与正常的鼻咽基质相比，POSTN在鼻咽癌基质中显著上调，而且高水平的POSTN与鼻咽癌患者的晚期临床分期、淋巴结转移和总体存活率降低显著相关。头颈鳞状细胞癌患者中的血清POSTN水平与血清VEGF-C水平和恶性肿瘤行为（包括增加的肿瘤分期和淋巴结转移）密切相关。POSTN促进的淋巴管生成是由癌细胞中增加的VEGF-C分泌和通过Src和Akt的活化引起的迁移和管状结构形成介导的。在透明细胞肾细胞癌中，POSTN是肿瘤相关成纤维细胞（CAF）分泌的，并且在肿瘤基质中堆积。这种肿瘤基质中的POSTN能够通过激活Akt促进癌细胞附着并增强成纤维细胞增殖。POSTN在胃癌中高度表达。POSTN是由肿瘤基质中的CAF细胞分泌的，并通过激活Erk促进胃癌细胞增殖。在浸润性黑色素瘤中，相比于正常组织，POSTN是高度表达的，而且它的表达局限于肿瘤基质中。这种肿瘤基质中的POSTN来自正常的人真皮成纤维细胞，能够在体外和体内加快黑色素瘤细胞增殖。考虑到POSTN在肿瘤进展中的关键作用，这种细胞基质蛋白可作为癌症的潜在诊断和治疗靶标。

作为一种分泌蛋白，POSTN主要是在正常组织的成纤维细胞和肿瘤基质中表达的。肺成纤维细胞分泌的POSTN可增强乳腺癌干细胞中的Wnt信号，从而促进肺转移瘤定植。还有人报道，一些癌症中的CAF细胞也会表达POSTN。欧阳高亮课题组在之前的研究中已证实POSTN在人骨髓来源的间充质基质细胞、间充质干细胞以及由间充质干细胞产生的脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞中高度表达。癌症相关脂肪细胞能够改变癌细胞的特征，赋予它们一种更具侵袭性的表型。因此，欧阳高亮课题组推测脂肪细胞产生的POSTN可能在脂肪细胞和癌细胞之间的相互作用中起着关键作用。间充质干细胞和骨髓衍生细胞（BMDC）能够特异性地迁移到肿瘤部位并在那里移植，从而肿瘤微环境的一部分。这种现象提示着由间充质干细胞和/或骨髓衍生细胞产生的POSTN可能参与调节肿瘤微环境。

在肿瘤微环境中，分泌的POSTN能够与αvβ3和αvβ3受体结合，从而激活各种下游信号途径，包括PI3K/Akt和FAK信号通路。激活这些下游信号通路能够促进肿瘤细胞的存活、迁移、浸润和血管生成。POSTN也与肿瘤转移相关，特别是结肠癌的肝转移以及乳腺癌的骨转移、淋巴结转移和肺部转移。POSTN促进肿瘤转移的潜在机制可能在于它在重塑癌干细胞微环境和转移微环境中发挥的功能。POSTN与Wnt信号相互作用，并为癌干细胞在较远部位中的自我更新和定植提供一种转移微环境。此外，高水平的POSTN和活性TGF-β1分布在新生血管尖端，并且在能够让休眠的肿瘤细胞经历转移生长方面发挥着关键作用。

综合这些发现，大多数成体组织中的POSTN水平通常是比较低的，然而，在损伤或炎症部位或成年有机体内的肿瘤中，POSTN通常是由被TGF-β、其他的局部和全身性细胞因子和生长因子激活的基质细胞高度分泌的，而这些细胞因子和生长因子是由上皮细胞和其他的细胞产生的，如图6所示。分泌的POSTN通过结合各种胞外基质蛋白来重塑局部的组织微环境，并且招募Wnt、Notch1或其他的配体来调节它们的信号通路，通过它的细胞表面受体αvβ3和αvβ3相互作用调节细胞内的PI3K-Akt和/或其他的信号通路，从而导致各种炎性反应和肿瘤进展。