二代测序浅析

那么，什么是二代测序呢？所谓二代测序，是由英文Next-generation sequencing翻译而来，即下一代测序。为什么大家叫它二代测序呢？其实，这个“二代”是相对我们所熟知的最初的测序方法——Sanger测序来说的。现用一张图（图1）来帮助大家更好的理解测序技术的发展。

图1.测序技术的发展

 

今天，我们就以DNA测序为例，聊聊目前主流的两种二代测序方法——Illumina公司的Solexa测序和ABI公司的 Ion Torrent 半导体测序的原理及各自的优劣势。

 

一、Solexa测序原理及流程（图2）

1. 测序文库的构建

首先将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头。

2. 锚定桥接

    Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。

3. 预扩增

    添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

4. 单碱基延伸测序

在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

图2. Solexa测序的原理及流程（a.建库；b.桥式PCR和检测。）

二、Ion Torrent 半导体测序原理及流程（图3、4、5）

1. 测序文库的构建

通过多重PCR的方法，对目的片段进行扩增，并在一端加上特定接头。

2. 乳液PCR（油包水PCR）

以一个乳液珠子为一个反应器，进行乳液PCR，对目的片段进行扩增。

图3.乳液PCR示意图

3. 微珠富集

图4. 微珠富集示意图

4.测序

图5.测序示意图

那么，上述两种测序平台到底哪个更好呢？从测序原理上来看，Illumina平台对于大片段的插入、缺失、融合检测有着先天的优势，而Ion Torrent 平台测大片段重复碱基时，无法准确识别碱基重复的数量。但从效率来讲，Ion Torrent 平台在测序时间上有着无可比拟的优势 ，且起始上样量低，这是它广泛应用于临床的重要原因之一。

 

虽然相对于一代测序，二代测序速度快、通量大、价格低，但是其准确度却低于一代测序，所以，目前一代测序仍是测序领域的金标准。