干货--microRNA必备知识系列

简介

MicroRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。最近的研究表明大约70 %的哺乳动物miRNA 基因是位于TUs区( transcription units , TUs ) ( Rodriguez et al ,2004) , 且其中大部分是位于内含子区( Kim &Nam , 2006) 。一些内含子miRNA 基因的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA 不仅在基因位置上保守, 序列上也呈现出高度的同源性(Pasquinelli etal , 2000 ; Ruvkun et al , 2001 ; Lee & Ambros ,2001) 。miRNA 高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA 与其靶基因的进化有着密切的联系, 研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。

MicroRNA

MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，几个miRNAs也可以调节同一个基因。可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。

MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300~1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70~90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt的成熟miRNA。

实际研究中，pre-miRNA应用最早，也最广泛，很多商业化的MicroRNA库都是pre-miRNA形式的。近几年来，研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着十分重要的作用，所以天然的pri-miRNA形式越来越多地被研究者采用。

MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。

特征

已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构，约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。

3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中，有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性（只有有1—2个碱基的区别）。Lau 和Bartel 实验室的同事更加认为：所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类，这些类似的基因被称为“直向同源物”）。

Bantam 最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子的转座子插入跨越这个位点的一段12.3kb区域会导致果蝇的眼和翅重复生长，而由转座子介导的一段跨越该位点的23kb片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。Cohen和同事用一段3.85kb的片断导入21kb片断缺失的果蝇中使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个3.85kb片断中的EST却没有同样的效果。Cohen将这个片断和疟蚊Anopheles gambiae的同源序列进行比较，发现一段90bp的高度保守区，经过RNA folding program (mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构，使得这个区段很象是一个miRNA的前体。这个结果经过Northern blot证实突变果蝇的幼体缺少一个21bp的bantam miRNA ，用这个90bp的mRNA前体经过一系列的“功能缺失”—“功能恢复”实验，证实 bantam miRNA在细胞增殖中的作用。研究人员用计算机程序检索在hid mRNA的3’非编码区找到了bantam的3个潜在的结合位点（ hid是果蝇中一个诱导凋亡的基因），并证实 bantam miRNA抑制hid 的翻译而非转录。

miRNAs的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。

功能

科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。

第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程(reviewed in Pasquinelli 2002)。

bantam miRNA是第一个被发现有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知还有一些miRNAs可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控，例如mir-14、mir-23 等。

在植物miRNAs的研究中有两条线索提示miRNAs可能参与植物的发育过程。一是在carpel factory (car) 突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPEL FACTORY 是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育。

对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育(Reinhart 2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代谢（Xu 2003)和细胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一个研究表明，2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin 2002)。

由于miRNAs存在的广泛性和多样性，提示miRNAs可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是：miRNAs可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。

然而，大多数miRNAs的功能仍然是个谜。

MicroRNA的过表达

MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA ，长度大约为300-1000个碱基pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA 即microRNA前体，长度大约为70-90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24nt的成熟miRNA 。

实际研究中，pre-miRNA应用最早，也最广泛，目前很多商业化的MicroRNA库都是pre-miRNA形式的。近几年来，研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着十分重要的作用，所以天然的pri-miRNA形式越来越多地被研究者采用。

MicroRNA的下调

赢润生物可以提供化学合成的miRNA inhibitors ，用于下调目的细胞中的miRNA ，以实现loss-of function研究。

如果您需要进行长期、稳定的miRNA下调，则可以选用赢润生物构建的载体形式的miRNA inhibitor。其转染效率高，下调效果好，可以实现对目的miRNA的长期、稳定的下调。

赢润生物载体形式的miRNA inhibitor，采用的是miRNA sponge法，这也是目前SCI文献中用的较多的一种方法。

作用方式

microRNA-RISC对靶基因mRNA的作用一直主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，有三种方式。

第一种是切断靶基因的mRNA分子——miRNA与靶基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA都以这种方式，靶基因mRNA断裂后，无poly(A)的分子的3‘ 端加上多个U并很快降解，含poly(A)的分子能稳定存在一段时间（如拟南芥miR-171）。在植物中目前有一个miRNA和3个潜在的目标靶基因完全互补（这些scarecrow 基因编码潜在的转录因子），尽管还不清楚这些基因是否就是miRNA的目标靶，这仍是第一次发现miRNA 和其潜在的目标靶完全互补，也提示miRNA可能包含和siRNA类似的作用方式。

第二种是抑制靶基因的翻译——作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类（如线虫lin-4）。而在植物中极少数的miRNA通过此方式来抑制靶基因。

第三种是结合抑制——具有以上两种作用模式：当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不完全结合时，起调节基因表达的作用。[1] 

识别方法

多个研究小组采用生物化学结合是生物信息学的方法开展对miRNAs的研究工作。由于据推测都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23个碱基大小、有5’端磷酸基和3’羟基的RNA片断，有的实验室采用改良的定向克隆方法来筛选具有相同特征的小分子——筛选一定大小的RNA分子，连接到3’和5’的适配子（adapters），逆转录并通过PCR扩增、亚克隆并测序。miRNA前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组数据库查询进行。这个方法有助于判断miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解产物。

有的实验室通过一种RNA folding program ’mfold’ 来判断C. elegans 和C. briggsae 之间的高度保守区域是否含有潜在的miRNA前体，然后用Northern Blots的方法来确定这些miRNAs是否真的表达了。

尽管有数百个miRNAs通过生化或者是生物信息学的方法被鉴别出来，已经鉴别出来的miRNAs只不过是沧海一粟，由于很多已经鉴别出来的miRNAs是从单个克隆中鉴别出来的，所以可以假设还有很多miRNAs在分离和鉴定过程中被“漏掉”了，测序工作还远远不够。

siRNA

miRNA和siRNA之间的关系令人迷惑。从表面上说，一个是非编码的单链小分子RNA，在进化上高度保守，通过翻译抑制调控基因表达；另一个是针对编码区的双链小分子RNA，每个转录本都可能有很多个siRNAs，是通过降解目标靶，在转录后调控基因表达。由于每个mRNA模版可能产生很多个siRNAs，要给每个siRNA定一个基因的名字就很困难。miRNA是进化进程中高度保守的，因此给直向同源物一个同样的名字可能有助于了解他们的功能，而给另一个物种中一段无关的序列一个同样的名字就容易造成混乱。

然而，据推测miRNAs通常是由较大的（70­90 nt）的茎环结构（发夹结构）前体经Dicer酶切割得到的，而Dicer同样负责将长双链RNA切割为siRNA，而且二者的长度也差不多，同样有调控基因表达功能。因而这两类小分子RNA之间的关系格外令人关注。

两个广为人知的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，通过一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制从而抑制蛋白质合成。这种结合并不诱导mRNA靶的降解，就是说作为翻译抑制子本身不影响对应mRNA的丰度，其原因据推测是由于miRNA和结合位点之间不完全互补。这就区别于siRNA的介导的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以类似siRNA的方式介导目的RNA的降解。实验表明引入和let-7目的mRNA靶完全互补的miRNA会诱导mRNA靶的降解。还有实验结果表明一些miRNA，包括在植物中发现的Scarecrow miRNA，能结合完全互补的mRNA链从而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。这提示miRNAs可以和siRNAs一样作用，这两种小分子RNA作用通路可能有重叠的部分。这种重叠同样提示siRNAs可能也有和miRNAs同样的功能。

一个很有趣的实验证实这个观点：Doench和同事挑选一个已知在体内可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在荧光素酶报告基因的3’端插入对应的CXCR4结合位点——其中一个拷贝是插入一个完全匹配的CXCR4结合位点，另一个拷贝插入4个只有3’和5’端匹配，而中间不同的CXCR4结合位点，这样选定的siRNA就不能完全结合到这个结合位点——中间形成一个突起的不匹配的环。将这两个拷贝转入Hela细胞并用siRNA诱导基因沉默。结果很有趣——两个实验都录得荧光素酶活性下降了超过10倍，RT-PCR和Northern分析证实，第一个实验的荧光素酶转录本下降了超过10倍，这正是正常的siRNA介导的RNAi反应，目标靶mRNA降解导致表达水平的下降，而第二个实验中荧光素酶转录本仅仅下降1.2倍，这种目的基因表达水平下看起来象源于miRNA介导的翻译抑制降，而不是siRNA介导的影响mRNA的稳定性导致。实验表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。实验人员还进行了另一个实验：改变第二个实验中的不匹配环的碱基序列看起来不影响抑制效果，但是siRNA和报告基因上的结合位点的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——这一点和siRNA抑制的情况一样——唯一不同的是：完全匹配的结合位点（siRNA作用方式）可以单独起作用而相互不影响，而增加不完全配对的结合位点（注意在第二个实验中用了4个CXCR4结合位点）的个数对翻译抑制有显著的加乘作用。

在哺乳动物细胞中还没有找到内源的siRNA，外源的siRNA介导的RNAi作用正是一种抵御机制。而miRNAs则广泛存在于哺乳动物细胞中，从理论上推测可能参与多种调控作用。这两种小东西的作用机制和相互关系的本质就显得更加扑朔迷离。如何在实验中正确鉴定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成为一个值得关注的问题。

待解决问题

miRNAs在多个物种中广泛被发现，而且在进化上高度保守。这些“小玩意儿”留给我们一大堆谜团：miRNA的确切功能是什么？它的目标靶是什么？作用机制是什么？也许需要对植物或者线虫的基因组进行miRNAs突变株的筛选，在果蝇中可以用targeted-disruption缺失miRNA序列。对miRNA突变株伴随的表型缺失进行研究，有助于解释miRNAs的功能。

正如Phillip Zamore说的：“如果miRNAs在进化的进程中如此高度保守而没有任何实际功能，那真是大自然拿科研人员开涮——而且是一个残酷的玩笑”。

研究工具

随着小分子RNA日益受到研究人员的重视，很多研究小分子RNA的新方法不断推出。

分离

由于小分子RNA可能参与分化、发育、组织生长、脂肪代谢等生理过程，在不同的组织和发育阶段的表达水平有所不同，进一步了解小分子RNA的生物功能需要确定其在各种生物样品中的表达水平，因而需要一种精确的定量纯化方法，从而得到可信的数据。

现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提 乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA（200nt以上），小分子RNA往往被淘汰掉，因而不适用于小分子RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留小分子RNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。mirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够有效富集10mer以上的RNA分子，又能够兼备离心柱快速离心纯化的优点，是一个不错的选择。对于特别稀有的分子，由于需要分离大量RNA而导致高背景而降低灵敏度，还可以进一步富集10mer到200bp的小分子RNA来提高灵敏度。

探针制备

方法其实很简单：只需要准备目的基因的一小段寡核苷酸序列，3’端另外增加8个和T7启动子互补的碱基，将这段寡核苷酸和T7启动子引物退火，用Klenow大片断补齐得到双链的转录模版，然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和标记物混合，体外转录得到标记的小分子RNA探针。这种方法可以快速制备各种标记（同位素、非放射性标记均可）的小于100nt的小分子RNA探针，适用于包括RPAs，Northerns 和原位杂交等各种方法检测小分子核仁RNA( small nuclear RNA,snRNA)，small interfering RNA (siRNA),，micro RNA (miRNA)和 mRNA。非放射性标记的探针还可以用于原位杂交研究miRNA或者mRNA在组织中的分布。

检测

由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究非常困难，多数研究人员采用Northern Blots——一种技术复杂而费力的方法来检测小分子RNA的存在。传统的Northern Blot的方法是是用探针检测固相支持物（膜）上的目标分子，由于用探针检测液相中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏，生物通在这里为大家推荐一种基于核酶保护分析方法改进的新方法——将同位素标记好的小分子RNA探针和待检测样品混合杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并纯化杂交的RNA分子，最后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。这个基于液相杂交的新方法不但操作简单而快速，而且灵敏度极高——可以半定量检测少至10ng总RNA模版中的小分子RNA，或者说，可以检测attomole (10-18 mol)级别的靶目标！灵敏度是Northern Blot的100倍。除此之外，研究人员还可以在同一个样品中同时检测多个小分子RNA和长的RNA模版。应该说，这个灵活巧妙的设计可以为从事小分子RNA实验的研究人员带来不少方便。

总而言之，无论是siRNA, miRNA, snRNA还是其他的小东西，小分子RNA研究的不断深入将帮助我们揭示更多生命的奥秘。

功能分析

miRNA 的上调可用于鉴定功能获得表型；抑制或下调可以研究功能缺失表型。

MicroRNA功能分析

上调与下调的结合可用于鉴定被特定miRNA 调节的基因，以及特定miRNA 参与的细胞进程。

主应用包括：

◇miRNA 靶定位点的鉴定和验证

◇筛选调节某个特定基因表达的miRNAs

◇筛选影响某个特定细胞进程的miRNAs

miRNA展望

编辑

miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多的引起研究人员的关注。随着对于miRNA作用机理的进一步的深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，将会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。

miRNA必备的知识

完整的miRNA调控的基因沉默的机制图

导语

miRNA的故事经久不衰，miRNA基础知识您知道多少呢？让小编给你讲讲miRNA的必备的基础知识吧！

1.什么是pri-miRNA，pre-miRNA，mature miRNA?

miRNA微处理器pri-miRNA结构特征图

pri-miRNA：长度从几百到几千个碱基不等，带有5‘帽子和3’polyA尾巴，以及1到数个发夹径环结构。

pre-miRNA结构特征图

pre-miRNA：pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的前体。

mature miRNA：pre-miRNA经进一步经过DICER酶剪切，形成长度约为22个碱基的单链成熟miRNA。

pri-miRNA>pre-miRNA>miRNA加工流程示意图

2.什么是miRNA种子区（“seed”region）?

5’端2-8个碱基被称为种子序列

miRNA种子区域靶标结合的示意图

3.miRNA与miRNA靶标结合类型有哪些?

miRNA与miRNA靶标结合主要有两类：5'-dominant Site和3'-compensatory Site

5'-dominant Site

5‘显性位点：满足经典种子区2-8完全互补结合的方式。

3'-compensatory Site

3’端补偿位点：5‘端并非满足2-8经典完全互补，知识部分互补，这样3‘端补偿位点结合，增强了miRNA与标靶结合稳定性。

4.miRNA命名与编号的方法和原则

1) miRNA(microRNA)成熟体命名规则(以动物miRNA为例)

①确定命名规则之前发现的miRNA(microRNA)，则保留原来名字，如hsa-let-7。

②miRNA(microRNA)成熟体简写成miR，再根据其物种名称，及被发现的先后顺序加上阿拉伯数字，如hsa-miR-122；

③高度同源的miRNA(microRNA)在数字后机上英文小写字母(a,b,c,…)，如hsa-miR-34a，hsa-miR-34b，hsa-miR-34c等；

④由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA(microRNA)，则在后面加上阿拉伯数字以示区分，如hsa-miR-199a-1和hsa-miR-199a-2；

⑤通常一个miRNA(microRNA)前体长度大约为70~80nt，很可能两个臂分别产生miRNA(microRNA)。

　　以前的做法是：

表达水平较高的miRNA(microRNA)后面不加任何符号，而表达水平较低的miRNA(microRNA)后面加上*号，如rno-miR-9*。有时带“*”的miRNA(microRNA)就根本不出现。

而如果没有明显的表达差异，则以“-5p”和“-3p”分别命名。如hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-26b-3p，分别表明从hsa-mir-26b前体的5’端臂和3’端臂加工而来的。

　　在以前的命名中，有时也会以“-s”和“-as”来命名，但现在已经取消了这种命名方式。

　　注意：miRBase新版本对miRNA(microRNA)成熟体的名称进行了大量的修改，很多带“*”的miRNA(microRNA)都变成了“-5p”或“-3p”。当然，新名称下面对应有其原来的名称。

2) miRNA编号及名称(以动物miRNA为例)

miRBase记录了miRNA(microRNA)前体序列及miRNA成熟体序列，其中：

① miRNA(microRNA)前体

发夹状结构的miRNA(microRNA)前体转录本以“mir”命名，其编号以“MI”编号，如人的miRNA 122的前体ID为hsa-mir-122，Accession为MI0000442。

② miRNA(microRNA)成熟体

　　大约20～23nt的miRNA(microRNA)成熟体以“miR”命名，其编号以“MIMAT”编号，如人的miR-122有两个成熟体，其中之一ID为hsa-miR-122-5p ，Accession为 MIMAT0000421;另一个为ID为hsa-miR-122-3p ，Accession为 MIMAT000 4590。

　　

3) 不同物种命名方式差别

①动物：

　　miRNA(microRNA)前体：以动物物种缩写 “-” mir “-” 命名顺序，如hsa-mir-122；

　　miRNA(microRNA)成熟链：以动物物种缩写 “-” miR “-” 命名顺序，如hsa-miR-122-5p；

②植物：

　　miRNA(microRNA)前体：以植物物种缩写 “-” MIR 命名顺序，如ath-MIR156a。注意：MIR是大写，并与命名顺序之间没有“-”；

　　miRNA(microRNA)成熟链：以植物物种缩写 “-” miR 命名顺序，如ath-miR156a。注意：miR是小写，并与命名顺序之间没有“-”；

③ 病毒：

　　miRNA(microRNA)前体：以病毒物种缩写 “-” mir 命名顺序，如bhv1-mir-B1；

　　miRNA(microRNA)成熟链：以病毒物种缩写 “-” miR 命名顺序，如bhv1-miR-B1。

5.miRNA预测方法

Diana-microT, TargetScanS和miRanda三种软件预测方法

预测没有绝对正确，按照软件评分为准。

6.miRNA作用机制中降解或抑制？

miRNA生物起源于作用机制图

miRNA降解mRNA：通过完全配对，降解mRNA抑制蛋白，qRT-PCR检测mRNA，WB检测蛋白都呈现明显的下调。

抑制mRNA翻译：通过部分配对，通过抑制翻译抑制蛋白，qRT-PCR检测mRNA没有变化，WB检测蛋白呈现明显下调。

作者：艾博思生物

在microRNA的研究中，生物信息学发挥越来越重要的作用，以下是microRNA相关的数据库与预测、功能分析软件  ，绝对值得收藏。

1.miRBase: http://www.

miRBase序列数据库是一个提供包括已发表的miRNA  序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库，是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一。miRBase提供便捷的网上查询服务，允许用户使用关键词或序列在线搜索已知的miRNA和靶标信息。

2.miRecords: http://mirecords./

动物 miRNA  的靶相互作用的数据库, 包括人工收集实验验证的, 预测的 miRNA的靶目标.    靶标预测工具DIANA-microT, MicroInspector, miRanda, MirTarget2, miTarget,    NBmiRTar, PicTar, PITA, RNA22, RNAhybrid, and TargetScan/TargertScanS.

3.PMRD: http://bioinformatics.cau.edu.cn/PMRD/

PMRD是一个关于植物MicroRNA  数据库，包括了microRNA序列和它们的靶基因、二级结构、表达谱、基因组搜索等等，并且该数据库尝试着整合大量的关于植物microRNA的数据。

4.CoGeMiR: http://cogemir./

CoGeMiR数据库总结关于在进化过程中MicroRNA  在不同动物中的保守性。该数据库搜集已知的和预测的microRNA关于染色体定位、保守性和表达谱方面的信息。

5.MicroRNAdb: http://bioinfo.au./micrornadb/index.php

MicroRNAdb是一个关于microRNA的综合性数据库。相比其他数据库，MicroRNAdb搜集的microRNA更完整且进行了充分的注释。如今，该数据库有732个microRNA序列的条目和439个详细的注释。

6.miRWalk: http://www.ma./apps/zmf/mirwalk/

miRWalkis是一个综合性数据库，提供来自人类、小鼠和大鼠的miRNA的预测信息和经过验证的位于其靶基因上的结位点。

7.TarBase: http://diana.cslab.ece./tarbase/

TarBase数据库人工搜集了实验验证过的miRNA的靶基因，包括在人、小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中的miRNA的靶基因，区分出这些miRNA靶基因中的对的和不对的。

8.miRGator:http://genome./miRGator/miRGator.html

miRGator数据库是一个引导对miRNA进行功能阐释的工具。功能分析和表达谱结合靶基因预测，可以对miRNA的生物学功能进行推测。

9.miRGen:http://www.diana.pcbi./miRGen.html

miRGen是一个整合型数据库,包括：(i)动物miRNA和基因组元件之间的位置关系;(ii)通过结合广泛使用的靶基因预测程序得到动物miRNA靶基因。

10.miRNAMap:http://mirnamap.mbc./

miRNAMap数据库搜集了多个物种的经过试验证明的microRNA和miRNA靶基因，其中包括人类的、小鼠的、大鼠的以及其他多细胞动物的基因组。

11.Vir-Mir:http://alk.ibms./cgi-bin/miRNA/miRNA.cgi

Vir-Mir数据库提供预测的病毒miRNA的候选发夹结构序列。

12.ViTa:http://vita.mbc./

ViTa数据库搜集来自miRBase、ICTV、VirGne、VBRC等数据库的病毒数据，包括了已知的病毒的miRNA以及相应的由 miRanda和TargetScan预测的宿主miRNA靶基因。ViTa还提供有效的注释，包括人类miRNA的表达情况，病毒感染的组织等。

13.ASRP Database:http://asrp.cgrb./db/

ASRP网站组织了拟南芥中的小RNA的信息，这些小RNA是通过ASRP或其他实验室分离得到的。

14.miRNApath:http://lgmb.fmrp./mirnapath/tools.php

miRNApath是一个关于miRNA、靶基因以及代谢通路的的数据库。

15.miRex:http://miracle.igib./mirex/

miRex是一个分析microRNA基因表达的在线资源库，搜集，整理和分析已发表的关于microRNA基因表达的数据，它允许研究者通过数千数据点来分析基因表达和提供microRNA基因表达数据的在线保存。

16.PolymiRTS:http://compbio./miRSNP/

自然产生的miRNA的靶标位点DNA变异的数据库

17.SeqBuster:http://estivill_lab.crg.es/seqbuster/

a bioinformatic web interface able to custom analyze deep    sequencing data to study miRNA variants or   isomiRs. From Genetic    Causes of Disease Group, Genes and Disease Program, Centre for    Genomic Regulation (CRG), Pompeu Fabra University, Barcelona,    Catalonia, Spain.

18.WMD3: http://wmd3../cgi-bin/webapp.cgi

WMD3 designs artificial microRNAs (amiRNAs). The 21mer    amiRNA21mers can specifically silenceg single or   multiple genes of    interest in more than 90 plants. From Max Planck Institute for    Developmental Biology, 72076 Tübingen, Germany.

19.TargetScan:http://www./

TargetScan是通过搜索和每条miRNA种子区域匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。

20.microRNA.org:http://www./

miRanda数据库提供了关于人类、果蝇和斑马鱼基因组的microRNA靶目标的预测信息以及miRNA在不同组织的表达谱。

21.PicTar: http://www./

icTar是通过一定计算法则来鉴定microRNA的靶目标的。该可搜索的网站可以提供以下物种的关于microRNA靶目标的预测详细信息，包 括：脊椎动物、七个果蝇种类、三个线虫种类和人类的非保守但共表达的microRNA的靶目标(例如：表达在同一组织的microRNA和mRNA)。

22.RNAhybrid:http://bibiserv.techfak./rnahybrid/

RNAhybrid是一种用于寻找一条长链RNA和一条短链RNA的最小配对自由能的工具，是通过一种域码来实现的。例如一条短链序列结合到长链的最佳位置上。该工具主要作为microRNA靶基因预测用

23.microInspector:http://bioinfo./microinspector/

microInspector提供miRNA结合位点的预测。

24.TripletSVM: http://bioinfo.au./mirnasvm/

TripletSVM是一个用于预测一个具有发夹结构的被查询序列是否是一个真正的miRNA前体物的程序

25.TransmiR: http://cmbi./transmir

TransmiR是关于转录因子的microRNA调节的数据库，对于用于学术研究室免费的。

26.miR2Disease:http://mlg.:8080/miR2Disease/search.jsp

miR2Disease数据库是一个人工注释的数据库，主要收录的是与人类疾病相关的microRNA信息

27.S-MED: http://www.oncomir./SMED/index.php

S-MED(肉瘤microRNA表达数据库)是一个存储miRNA表达谱的数据库，这些miRNA是在多种人的肉瘤中以及一些选择的正常组织中发现的。

28.PMRD：http://bioinformatics.cau.edu.cn/PMRD/

植物microRNA数据库

26.deepBase： http://deepbase./

deepBase从新一代测序技术(深度测序技术，deep-sequencing)数据中注释和鉴定microRNA，piRNA，siRNA基因及长非编码RNA基因及其他们的表达模式。

30.starBase： http://starbase./

starBase    从高通量的CLIP-Seq实验数据(CLIP-Seq和HITS-CLIP)和降解组实验数据中(degradome sequencing)搜寻micorRNA的靶标。提供了各式各样的可视化界面去探讨microRNA的靶标

31.PITA: http://genie./pubs/mir07/mir07_data.html

PITA基于靶位点的可接性(target-site accessibility)预测microRNA的靶标。

32.RNA22：http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html

RNA22基因序列特征预测microRNA的结合位点。

33.miRTarBase:http://mirtarbase.mbc./index.html

一个全面收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。

34.miRanda： http://www./microrna/home.do

miRanda是John等于2003年5月开发的第一个miRNA靶基因预测软件。miRanda适用范围广泛，不受物种限制，同时提供了windows,linux,和macintosh多平台版本，可以下载到本地运行。碱基互补方面，miRanda算法和Smith-Waterman算法相似，但它以碱基互补(如A=U,G≡C等)代替Smith-Waterman算法中的碱基匹配(如A-A,U-U等)来构建打分矩阵，允许G=U错配，为了体现miRNA3’端和5’端和靶基因作用过程中的不对称性，软件给出了scale参数(5’端11个碱基得分值乘以该值，然后和3’端11个碱基得分值相加作为碱基互补得分)。同时强调miRNA第2到4位碱基和靶基因精确互补，第3到12位碱基和靶基因错配不得多于5个，9到L-5(L为miRNA总长)位碱基至少一个错配，最后5个碱基错配不得多于两个。

35.DIANA-microT： http://www./microT

DIANA-microT是KiriakidouM等基于实验和计算生物学方法开发的miRNA靶基因预测软件。和miRanda预测结果中可能出    现一个miRNA对应多个靶位点或多个miRNA对应一个靶位点而丢掉了miRNA调控单个靶位点不同的是，DIANA-microT考虑了miRNA调    控单个靶位点的情况。

DIANA-microT预测算法基于以下两点来判别miRNA靶基因：

①miRNA和靶基因间的高亲和力，主要通过结合能来衡量。

②影响miRNA和靶基因所形成二聚体茎环结构环部位置和环大小的miRNA相关蛋白可能指导miRNA和靶基因的相互作用。

36.RNAhybrid： http://bibiserv.techfak./rnahybrid/

RNAhybrid是BehmsmeierM等[15]基于miRNA和靶基因二聚体二级结构开发的miRNA靶基因预测软件。RNAhybrid预测算法禁止分子内、miRNA分子间及靶基因间    形成二聚体，根据miRNA和靶基因间结合能探测最佳的靶位点。尽管随着靶基因序列长度增加，运算复杂度也相应增加，但RNAhybrid和其它RNA二级结构预测软件诸如mfold, RNAfold,  RNAcofold和pairfold相比，仍具有明显的速度优势。此外，RNAhybrid允许用户自定义自由能阈值及p值，也允许用户设置杂交位点的偏向，如杂交位点必须包含miRNA 5’端2-7nt等。