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赵承彦 [摘 要] 细胞毒检验是了解和评价机体免疫功能状态的重要方法。以51Cr释放法为代表的细胞毒检验方法，包括镧系元素标记法，酶释放法，生物发光法和荧光标记流式细胞术方法等统称为传统细胞毒检验方法（TCA），以效靶细胞比为条件检测的杀伤率，用杀伤率做细胞毒活力指标，违背细胞毒性反应规律，实验结果不反映细胞毒活力。正确认识和检讨TCA方法存在的问题，对细胞免疫学研究和应用具有重要意义。 [关键词] 细胞毒；细胞毒活力检验；剂量-效应曲线 The principle wrong for traditional cytotoxicity assay Corresponding Author: Zhao Chengyan, Department of biomedicine, Henan tumor institute, Zhengzhou 450003, China. E-mail: cyzhao.01@163.com. 1．细胞毒检验的基本概念现代免疫学阐明，免疫是机体识别和排除抗原性异物的反应。免疫反应机制和反应过程非常复杂，有各种各样的免疫细胞和免疫因子参与，既有免疫识别反应，也有免疫杀伤和免疫排除反应。免疫杀伤介于免疫识别与免疫排除反应之间，是免疫细胞和免疫因子引起病原体感染细胞、变异细胞和癌变细胞死亡的反应形式。免疫杀伤既有免疫细胞的作用，也有免疫因子的作用，起杀伤作用的免疫细胞和免疫因子称为效应细胞和效应因子，被杀伤的细胞称为靶细胞。免疫杀伤反应发生需要一定条件，一是效应细胞对靶细胞有反应活性，即有识别能力和毒杀作用，二是效靶细胞有接触的机会。免疫细胞杀伤靶细胞的反应也称为细胞毒性反应。 细胞毒检验是认识和评价机体免疫反应能力的实验方法。细胞毒检验方法历来为免疫学界所重视，半个多世纪来相继建立了十多种细胞毒活力检验方法。51Cr释放法[1-2]是较早建立的一种方法，该方法涉及辐射防护、污物处理和昂贵的检测仪器，不易普及应用。随后建立了时间分辨镧系元素标记法[3]，各种酶释放法[4-6]，生物发光法[7,8]，荧光标记流式细胞术方法等[9-11]，后续方法都遵循同样的方法原理和实验条件，只是定量靶细胞方法不同，统称为传统细胞毒检验方法（traditional cytotoxicity assay，TCA）。 51-铬释放法已经应用了半个多世纪，有人将其奉为细胞毒实验方法金标准。实际上51-铬释放法原理和实验条件都不对，用杀伤率做细胞毒活力指标是原理错误，用效靶比作变量检测杀伤率是实验条件错误。TCA方法都遵循同样的原理和实验条件，所以都是错误的。 2. TCA违背细胞毒反应规律细胞毒性反应似于药物毒性反应，虽然免疫细胞不是药物，但免疫细胞毒杀靶细胞的作用形式与药物毒杀靶细胞相似，两者遵循同样的规律。药理学研究表明：药物毒性反应，效应是剂量的函数。如果用效应强度为纵坐标，药物剂量（浓度）为横坐标作图，呈二维双曲线，将剂量改用对数值作图，呈S型曲线，称为量效曲线。S型曲线表示，药物剂量很低时不产生效应，达到阈值剂量以后效应随着剂量增大而增强，在线性区效应随剂量增加很快，接近饱和剂量时，效应随剂量变化减慢。药物毒性一般用剂量参数LD50和LD90作指标[14-18]，通过测定量效曲线获得。 细胞毒反应遵循药理药效学原理， 细胞毒效应是细胞剂量的函数，即杀伤率（Killing Rate, KR）随细胞密度变化。细胞密度很低时，效靶细胞接触机会很小，杀伤率很低；随着细胞密度增高，效靶细胞接触机会增多，杀伤率增高；达到饱和密度时，由于非活性细胞的阻碍作用，效靶细胞接触机会不再增大，杀伤率也不再升高。TCA以效靶细胞比为变量检测KR，效靶细胞比不是细胞密度，与KR没有量效关系。KR只是个效应指标，不与剂量相关联不反应药理性能。 3. 杀伤率不反映细胞毒活力认识TCA的问题，需要明确细胞毒性反应原理。细胞毒性反应是指免疫活性细胞杀伤变异细胞的作用过程。免疫活性细胞有很多种类型，靶细胞也不是一种类型。效应细胞一般是由多种免疫活性细胞构成的混合体，有时一种效应细胞可以杀伤某几种靶细胞，有时几种效应细胞杀伤某一种靶细胞。相对于某一种靶细胞，效应细胞中总有活性细胞和非活性细胞。效应细胞中活性细胞占有的比率称为免疫活性细胞频率(Cytotoxic Cells frequency, CCF)。 杀伤率（KR）是一个效应参数，是实验检测到的死伤靶细胞数与靶细胞总数之比率。是一个实验值，决定于实验条件。细胞毒活力实验，效应细胞发生免疫杀伤反应需要2个条件：一是有细胞毒活性细胞（CCF）。二是效靶细胞有接触机会。CCF由样本属性决定，样本一定CCF一定，不随实验条件改变。效应细胞密度(effecter density, ED)是指单位体积内分布的效应细胞数，机体内不同组织部位免疫细胞密度不会相同，创伤和病变部位会聚集较多免疫细胞，即使血循环体系不同生理情况下免疫细胞分布密度也不会一样。体外细胞毒活力检验是在细胞培养板上进行，效应细胞密度是指单位面积上分布的效应细胞数，是人为设置的实验值。体内体外细胞密度是两个概念。 效应细胞杀伤多少靶细胞决定于检测单位内的CCF和效应细胞密度。CCF由样本决定，不随实验条件改变， KR只是细胞密度的函数，所以测定KR应该以细胞密度为变量。TCA都是以效靶细胞比为变量而不是以细胞密度变量。效靶细胞比与细胞密度(ED)不是一个概念，也没有相关性。同样的效靶比，细胞密度可以不同。固定效靶细胞比不变，可以做成许多个细胞密度，细胞密度不同，效靶细胞接触机会不同，杀伤率不同。所以同一个细胞样本，维持效靶比不变，做成不同的细胞密度，可以测出许多个杀伤率。一个细胞样本应该只有一个杀伤率，同一个效靶比，由于细胞密度不同测出许多个杀伤率，哪一个结果代表样本属性？显然是有问题的。 由于TCA只限定效靶比，不限定细胞密度，同一个细胞样本各个实验室，不同实验者，不同批次，由于实验用的细胞密度不同，结果各不相同。因此TCA方法实验结果没有可比行，无法建立细胞毒检验标准。 统一效靶比不能解决问题，统一细胞密度行不行？TCA可以标准化细胞密度，但体内细胞密度与体外细胞毒实验的细胞密度意义不同。体内细胞处于立体移动状态，体外细胞毒实验细胞处于平面静止状态，体外无法构建与体内完全相同的细胞密度，实验测得的杀伤率不代表机体细胞毒活力。所以用杀伤率作细胞毒活力指标是错误的。 4.效靶细胞比不影响杀伤率TCA方法以效靶细胞比为自变量测定杀伤率。显然认为杀伤率与效靶比有关，效靶比高杀伤率大。这种认识是不对的。TCA方法，细胞毒性反应是在平面上进行，效应细胞与靶细胞在平面上均匀分布，彼此之间相对静止。效应细胞中有活性细胞，也有非活性细胞，只有活性细胞与靶细胞接触才能发生杀伤反应。一般是效应细胞多，靶细胞少。细胞密度大，细胞之间距离小，效靶细胞接触机会多，靶细胞被杀上的几率大。即使一个靶细胞同时与一个或几个效应细胞接触，由于非活性细胞总是多于活性细胞，总有靶细胞没有被杀伤，一般情况下测不出100%的杀伤率。只有在特殊条件下，即效应细胞全部是细胞毒活性细胞，至少CCF在 80%以上，而且靶细胞相对较少，才有可能测出100%的杀伤率。在细胞密度一定的条件下，效靶比低，相对靶细胞少，被杀伤的靶细胞也少，而没有被杀伤的也少；效靶比高，相对靶细胞多，被杀伤的靶细胞也多，而没有被杀伤的靶细胞也多，杀伤比率不变。因此效靶细胞比不影响杀伤率。举一个相似的例子，细胞毒性反应类似于空降兵掉进地雷阵。地雷防区内，地雷均匀埋设，地雷密度决定伞兵生存率，密度大间距小，生存率低。一个伞兵跳下来和多个伞兵跳下来生存率一样，跳下的人多，生存下来的人多，死亡的人也多，比率没有变。 怎样认识TCA检测同一个细胞样本，效靶细胞比高KR也高的实验结果？TCA检测细胞毒活力，都是记录标记靶细胞变化，标记信号太低检测不出来，要求有足够多的靶细胞。以五千为例，效靶细胞比10/1，效应细胞为五万，效靶比50/1，效应细胞为25万，实验一般在96孔细胞培养板上进行，培养板孔径一样，效应细胞密度不同，高效靶比的细胞密度是低效靶比的5倍，自然测出的KR高。影响杀伤率的是效应细胞密度而不是效靶细胞比。 5. 细胞免疫杀伤活力的指标应该是效应细胞中活性细胞频率细胞毒活力是指效应细胞产生细胞毒反应的能力，能力大小决定于效应细胞中对靶细胞敏感、能杀伤靶细胞的细胞毒活性细胞频率(CCF)。CCF具有样本属性，与免疫细胞杀伤活力直接相关，不同个体的CCF各不相同，决定细胞毒活力不同。健康人群CCF维持一个正常值水平，CCF水平低的个体免疫细胞杀伤活力会低。而且CCF在体内状态与在体外实验条件下一样，不会随实验操作而改变。所以CCF 是理想的细胞毒活力指标。 杀伤某一种靶细胞的效应细胞(CCF)一般不是单一细胞，而是多种免疫细胞的集合体，不能用检测细胞表面标志物的方法测定，而且CCF是指具有杀伤活性的活细胞，细胞死亡表面标志物并不消失。一个科学、实用的细胞毒活力检验方法应该能够检测CCF。 6. 能够检测CCF的细胞毒实验方法TCA的问题还没有被认识，TCA现在还在应用，还在继续影响细胞免疫学的研究和应用。这种状况应该尽快改变。通过对TCA方法的认识和检讨，我们建立了一个能够检测CCF的细胞毒实验方法，叫做极限稀释细胞克隆抑制试验（limiting dilution clone inhibition assay, LDCIA）[21]。LDCIA遵循药理学原理，以效应细胞密度为变量测定克隆抑制率，通过量-效曲线确定100%克隆抑制率对应的效应细胞密度 (Density of 100% inhibited, ID100)。ID100具有样本属性。健康人群的ID100有一个正常值，对应一个CCF值。只要测定实验样本的ID100，通过与ID100正常值比较，就可以确定样本的CCF。LDCIA根据极限稀释原理，用全或无计数方法定量靶细胞变化，不用标记细胞，实际应用证明是一个科学、实用的细胞毒活力实验方法。 |
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