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【必看】使用 Primer-Blast 比对引物的特异性

2018-08-14  汐洋99
使用 Primer-Blast 比对引物的特异性


什么是引物的特异性

引物是一段短的单链寡核苷酸,在PCR过程的退火阶段,引物与单链模板结合,DNA聚合酶沿着引物的3末端向后进行DNA的合成。引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则,因此,当退火温度不合适或引物设计不合理时,引物会结合到模板的非目标区域,从而导致其他片段的扩增。


所谓引物特异性,就是引物结合模板正确位置的能力,或者避免结合非目标位置的能力。引物的长度、GC含量、碱基分布、Tm值等性质,均会影响其特异性。


Primer-Blast比对引物特异性的原理


NCBI收录了诸多物种的基因组DNA、编码序列mRNA以及其他相关核酸序列的数据。使用Primer-Blast进行比对,首先要输入一对引物序列,并选择序列所属数据库。此时系统将在该数据库中对序列进行查找和对比,并将引物可能结合的位置进行记录,一旦结合位置处于两条链并且产物大小符合要求,系统就会将这种情况列举到结果中。需要注意的是,结合模板的引物不仅是一条正向一条反向,也有可能是两条正向或者两条反向引物。


Primer-Blast比对引物特异性的步骤


打开NCBI,进入Blast,网页如下:


点击上图红框标记的Primer-Blast,进入如下界面,在界面引物序列处,将正反向引物序列粘贴进去,5-3方向。产物大小默认为70~1000,可以根据实际情况进行调整。


选择相应的物种和参考数据库。

首先,要确保Specificity check一栏中已经打勾。Search mode一般选择Automatic即可。

物种:人源的基因选择Homo sapiens(taxid:9606);小鼠的选择Mus musculus (taxid:10090);大鼠的选择Rattus norvegicus(taxid:10116)。

参考数据库:要看PCR的模板是什么,如果是提取的RNA反转录后得到cDNA就选择Refseq mRNA(针对mRNA)或Refseq RNA(针对mRNA和lncRNA);若模板是基因组,则应该选择Refseq representative genomes。在Exclusion行中,可以对预测的序列以及环境/不可培养样本序列的干扰。


选好数据库和物种后点击页面左下角的Get Primers,系统进行分析,一段时间后会进入如下页面:(该页面以一对人EGFR的qPCR引物为例)


上图显示了多个结果,原因是EGFR基因有多个转录变体,这对引物能够将下方显示出来的变体都检测到。


每个结果分为多个部分:

第一部分为比对出来的基因结果;对于mRNA数据库,提供了该mRNA的NM号,对于基因组数据库,则会显示出基因组编号,点进去会出现预测的产物序列。

第二部分为预测出来的产物大小。

第三部分为正反向引物和模板的结合形式,“点”代表该位置的序列和模板完全互补配对。


非特异性结果如下:

如上图,红框位置并非是“点”,而是碱基,说明该位置跟模板不匹配,这种属于潜在的非特异性扩增结果。


对于非特异性结果的判断


对于常规PCR,产物可以通过凝胶电泳对非特异性条带进行分离,引物的非特异性并不是很重要,但是对于SYBR Green染料法荧光定量PCR,引物的特异性则非常重要。


但是,并不是说预测出了非特异结果,引物的性质就一定不好,需要具体情况具体对待

首先,引物的3端对扩增效率的影响是非常大的,如果预测出的非特异性结果中,3端存在不匹配碱基,说明即使引物能够结合模板,但3端会翘起,导致无法扩增,这一类的非特异结果可以忽略。

其次,PCR的产物大小是有限制的,尤其对于qPCR,由于延伸时间非常有限,大于1000的产物是基本上无法扩增出来的,如果非特异性产物远大于目的产物大小,这种非特异性结果也是可以忽略的。


Primer-Blast比对引物特异性的意义

当然,任何引物工具或者软件,都是根据一定的参数和算法进行的预测,结果只是起到了参考、建议的作用,并不能代表该引物的实际使用情况。


特性好的引物在实际使用过程中不一定表现优秀,反之预测特性不好的引物也不一定不能使用。一对引物究竟好不好用,最终还是要通过实际实验来验证的。也正是因为如此,生工生物免费引物设计服务是默认不经过Primer-Blast的。


但也不是说Primer-Blast一点实际意义没有,比如在上述EGFR案例,可以准确判断一对引物是否能够将该基因的所有转录变体覆盖到。NCBI的引物设计工具凭借基因序列直达引物设计的入口、其丰富的设置选项、特异性预测的功能还是得到了广大科研工作者的青睐,熟悉掌握了该工具,将为您的分子生物学实验起到很大帮助。



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