变异位点的准确识别

目前，随着成本的降低，二代测序技术在遗传学及医学中的研究和应用越来越普遍。得益于不同方式的测序(panel/WES/WGS）,以及大样本的测序数据的积累，大量的致病基因及位点被发现，极大的促进了相关领域的科学发现,也使基因检测日益成熟。其中，如何从测序数据中准确的进行变异检测，是后续生物学及医学研究的基础。变异位点通常包括：点突变（SNV），短的插入缺失（Indel），拷贝数变异（CNV）及结构变异（SV）等。不同的变异类型的变异检测方法和准度均存在差异。本文主要从三个方面论述变异位点的相关问题：

1，变异识别的准确度估计

通常，Sanger等一代测序技术作为金标准，用于对二代测序的位点进行验证。但是由于人类基因组变异位点的数量极为庞大，对这些位点进行大规模的验证是不可取的。那么，对于一个变异数据集如何从整体上评估其变异的可信度？主要有两个指标：

1）针对SNP的变异类型，即转换(T_i)/颠换(T_v)的比例，研究表明T_i/T_v=2.1:1[1]，即存在一定的偏好性；根据某一SNP变异集的T_i/T_v值偏离此范围之程度，来判断其可信度；

2）判断变异集合中属于dbSNP数据库之比例；通常认为，对于某一个个体，检测的变异位于dbSNP[2]中，则其可信度较高；而新位点（novel variants）则暗示着较大比例的假阳性。

虽然有综述文章[3]表明主流的测序平台正确率极高（99.99%~99.9999%），然而，由于人类基因组碱基数目的巨大，进而导致识别的碱基错误的绝对数量仍较为庞大；Li Heng[4]通过一个单倍体CHM1hTERT的65x的测序数据，同时，还采用Illumina Platinum Gen omes project的NA12878作为阳性对照（55x），在考虑体细胞突变的情况下，发现杂合位点假阳性的概率约为：1~100–200 kb；(即在全基因组水平上15000-30000的假阳性杂合位点)。总之，二代测序同时有准确度高和假阳性和假阳性绝对数量大的特点

2，真实变异数据集

构建人类个体的标准变异数据集，在评估测序数据质量、变异检测流程准确度方面有重要的作用。目前，普遍使用的真实变异数据集为NA12878个体的两套标准变异数据集：

1）National Institute of Standards and Technology (NIST)组织开展的的Genome in a Bottle Consortium计划中，Zook J M等人采用Illumina，454，SOLiD4，Complete Genomics，Ion Torrent共 5种测序平台对样本NA12878进行测序，利用7种比对方法以及3种变异检测工具组合而得到的14个数据集（11个全基因组和3个全外显子组），通过整合多种平台和数据库来确定SNP和INDEL变异位点的置信程度，提供了一个高置信的变异位点集[5]。然而，该数据集不包括约23%的基因组部分。此外，该研究仍在进行基于种群的高置信变异位点构建工作。

2）Illumina Platinum Project:该计划对CEPH 1463家系的17个成员分别采用Hiseq 2000进行50x测序。此外，对NA12877, NA12878及NA12882 trio家系还进行了200x 的HiSeq 2000测序其中，建库技术为TruSeq DNA PCR-Free Library Prep Kit；并采用多种生物信息分析流程来进行变异检测，最终的高置信变异集合综合考虑了家系遗传和多种方法的结果而得。同时提供了NA12877 和NA12878两个个体的标准变异数据集。

3，影响变异检测的主要因素

影响变异检测的因素是多方面的，涵盖了从实验环节到信息分析环节：

1） 测序方式

目前主要是选择全外显子组测序（WES）还是全基因组测序（WGS）。一项基于WGS和WES的比较研究[10]发现：WGS对编码区有更好的捕获效率；以覆盖度20x为标准，95-160x的高测序深度的WES可以捕获95%的编码区域；而87x的WGS捕获率即为98%。目前，随着测序成本的降低，WGS越来越成为科学研究中的主流方案。

2） 测序平台

不同的测序平台，在reads读长、碱基的识别方面均有差异。其中，Illumina平台易出现替换错误（substitution errors），同时由于单链DNA的折叠和酶的碱基序列偏好性修饰导致一些序列特异性错误。单分子的Pacific Bioscience虽然有读长长的优势，但易导致indel错误，而基于焦磷酸和半导体测序技术则在homopolymer易出现延后的indel错误[3]。J F等人比较了一个trio家系在Illumina HiSeq，Life Technology Proton和Complete Genomics三个测序平台的测序一致性，结果（见图1）显示三者在SNP的检测上仅有66%的一致性，而在Indel上仅有18%的一致性[6]。总之，各个平台技术均有所优劣，目前主流的为Illumina平台，而国产的华大BGIseq序列的使用也较为普遍。

3) 信息分析方法

基于Genome in a Bottle (GIAB) 联盟提供的NA12878标准变异数据集，Sohyun Hwang[7]对12种测序数据，系统比较了BWA-MEM, Bowtie2以及Novoalign三种比对工具，以及GATK-HC，Samtools，Freebayes，Torrent Variant Caller (TVC)四种call变异软件组成的13种分析流程在变异检测结果上的不同；其中，12种数据集信息见下表：

结果表明，各种分析流程在变异检测的敏感性和特异性方面均有所差异。建议采用主流的BWA-GATK流程进行变异检测，同时综合其他分析流程的结果。

总之，目前的变异检测方案是比较成熟的，适合大规模的科学研究和临床应用。但是，进一步提高变异检测的准确度，降低假阳性和假阴性比例，仍需要新的测序技术和变异检测工具的开发。