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杂志名称：Acta Biomaterialia 文献题目：Cui L H, Joo H J, Kim D H, et al. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates[J]. Acta biomaterialia, 2018, 65: 272-282. 第一作者：Long-HuiCui 通讯作者：Do-SunLim 作者单位：Department of Cardiology, Cardiovascular Center, Korea University Anam Hospital, 145, Anam-ro, Seongbuk-gu, Seoul 02841, Republic of Korea 本实验所用产品：RayBio Human Angiogenesis Antibody Array Cseries 1000(AAH-ANG-1000-8) 实验样品：内皮细胞集落形成细胞（hECFCs） 研究背景： 近期，生物材料的纳米表面形貌在细胞工程学中可作为兼容性生物学工具，可作为关键的参数，通过接触诱导，调控细胞行为。许多研究企图弄清纳米表面形貌的功能，以及受到纳米表面形貌影响的细胞在不同形貌结构中依赖于怎样的物理条件。这些研究包括确定的纳米几何结构和不规则的纳米几何结构，不充分地评估纳米大小对细胞应答的刺激作用。只有少数研究小组尝试通过纳米大小，说明不同纳米大小尺寸对细胞应答的影响。 外周血中得到的内皮祖细胞(hEPCs)具有并入损坏血管内皮组织提供再生修复的功能。内皮集落形成细胞(Human endothelial colony forming cells ，hECFCs)，是内皮祖细胞的一种亚型，作为一种在可用于临床上的细胞来源，可治疗多种血管疾病，应用于多种医疗设备和材料。 许多研究表明，相对于细胞微环境，细胞对纳米形貌更敏感。因此，研究人员假设hEPCs能被微环境（包括多种纳米表面形貌）影响。在本研究中，研究人员阐述了不同纳米大小的梯度纳米颗粒结构，能形成动态物理条件，对调控细胞行为有潜在能力。期望这些发现能帮助理解纳米刺激对外周血分离出hECFCs的作用，并为细胞工程提供一种纳米拓扑结构设计的基本原理。 1 结果 1.1 制备梯度纳米形貌板 细胞外基质（ECM）以异质性纳米级蛋白纤维包裹血管。研究人员观察毛细血管内表面的多种纳米特性形貌尺寸（1A）。毛细血管内表面中，这些凸面直径范围大多数（84%）在100-200nm（1B）。因此，研究人员假设纳米形貌的特征可能提供某种物理条件，调控hECFCs内皮细胞集落形成细胞的功能性应答。 受到血管内皮表面各向异性的纳米形貌的启发，研究人员制作了梯度纳米柱板。采用阳极氧化铝（anodic aluminum oxide，AAO），梯度蚀刻，形成梯度纳米孔模具（规则六边形纳米孔阵列，直径在120和440纳米）。通过1H，1H，2H，2H-全氟癸基三氯硅烷（heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane ，HDFS）自组装单层膜处理。AAO模具压印聚苯乙烯基板，形成一层不同直径的纳米柱(2A)。根据纳米柱薄膜的直径范围，特定为纳米GP 120/200, GP200/280, 和 GP 280/360。SEM电镜成像分析，展现连续性纳米柱模型（箭头指向纳米柱）（2C）。 1.2 梯度纳米柱板培养的hECFCs细胞应答 为评估纳米柱直径影响hECFCs细胞的应答，研究人员先在梯度纳米柱板涂上0.1%凝胶，帮助细胞粘附。hECFCs消化成单层细胞，培养在GP 120/200, GP 200/280, 和GP 280/360的平板2天，同普通平板（无纳米柱），对比细胞形态。2天后，普通平板的hECFCs细胞表现出一种扁平形态，培养在纳米柱板中的细胞表现更圆的形态（3A）。纳米柱板的hECFCs的面积和周长（3B/C）。这些结果说明了，纳米柱尺寸是一个关键参数，影响hECFCs的形态大小。 在内皮细胞中，早期伪足状连接对建立成熟细胞间相互作为有重要作用。本研究中，在GP 120/200板中的hECFCs细胞边缘，丝状伪足数目明显增加。GP 200/280 和 GP 280/360板中无伪足形成变化（3D/E）。研究人员的研究结果表明，纳米柱锚固点可以作为hECFCs丝状伪足生长的灵敏度参数，细胞对120–200 nm直径范围的纳米柱最敏感。这些结果表明，梯度纳米形貌板影响hECFCs.的细胞应答。 此外，通过血管生成因子蛋白芯片检测，在GP 120/200，GP200/280，和GP 280/360中培养的hECFCs中，RANTES和TIMP-1蛋白表达水平上调（S 6B）。这些发现表明，梯度纳米柱板有望改善HCFCs血管生成潜能。 1.3 梯度纳米柱板培养的hECFCs中黏着斑蛋白和F-肌动蛋白结构的调节 ECM基质中的细胞锚固点可能在多方面影响细胞应答，如FA（FA是关键内皮复合交叉结构，可以调控内皮细胞血管生成）和细胞骨架重塑。为研究hECFCs在梯度纳米柱板中的动态粘附变化，将细胞进行黏着斑蛋白（一种FA标记物）和F-肌动蛋白（一种细胞骨架标记物）染色。荧光免疫成像说明，在GP 120/200, GP200/280 和 GP 280/360培养的hECFCs中黏着斑蛋白和F-肌动蛋白装配的过程，但普通平板中无现象（4A）。这些结果暗示，梯度纳米柱板中的纳米柱可作为hECFCs中的FA调控者。 FA激活信号通路能通过形貌基质和细胞骨架重塑调节动力转导。有研究表明，FA装配能引导细胞骨架改变，可能与细胞基质的感应力有关。FA斑块大小粒度分布说明，不同直径的纳米柱能在hECFCs中诱导不同大小的FA复合物，GP120/200中，大于2μm×2μm的FA斑块面积最大。这些结果表明，纳米柱尺寸是调控FA结构装配的关键参数，能诱导hECFCs中FA-连接的细胞骨架排列。这些结果暗示，梯度纳米柱板主要通过改变FA和细胞骨架动力学，以此调控hECFCs应答，调控 。 1.4 通过抑制Rho-相关蛋白激酶(ROCK)，抑制梯度纳米柱板培养hECFCs的FA装配 在血管再生中，VEGF诱导内皮细胞迁移是重要过程，由FA结构装配和分解速率调控。测试梯度纳米板的物理途径能否改变hECFCs的基因表达，分析细胞骨架特异性标志物，如ROCK1 和 ROCK2。qPCR数据表明，ROCK1和ROCK2表达水平升高。结果说明，在hECFCs中，纳米柱刺激FA装配，能调控ROCK基因表达。 为了阐述梯度纳米板如何改变ROCK表达，研究人员对比了Y27632（一种ROCK抑制剂）处理组和非处理组hECFCs的FA斑块大小，发现ROCK抑制剂减小了纳米梯度板中hECFCs的FA斑块大小（5D）。这些结果反映了，通过ROCK信号，纳米形貌能调控hECFCs的FA斑块大小和细胞骨架排列。通过梯度纳米柱板影响细胞骨架相关基因，改变基因表达。 结果暗示在GP 120/200纳米柱板培养的hECFCs中，ROCK1和ROCK2表达水平相对于正常平板明显较高。说明，120-200nm直径范围的纳米柱，促进体外hECFCs的细胞应答。
结论： 在本研究中，研究人员精确模拟了梯度纳米形貌。实验结果说明了hECFCs是一种对梯度纳米柱板灵敏的细胞。进一步，这些结果表明，纳米形貌可能诱导与这些蛋白（外周血衍生hECFCs的ROCK）表达相关的mRNA改变。这些梯度纳米板的特性在细胞工程上的应用有很大的希望，并可应用于其他受纳米形貌刺激的自体细胞生物学中。
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