引自生命的奥秘:http://www./?p=24351 当蛋白质经过内质网(endoplasmic reticulum,ER)的时候,会有一套“质控”系统暂时将那些新合成的蛋白质“扣留”下来,帮助它们成熟。只有折叠正确的蛋白质才会被“释放”,而那些不能成熟的蛋白质则会被继续“关押”,但是这样会损害内质网的功能。因此,为了维持内环境的稳态,蛋白质质控系统会将这些“不合格产品”移交到胞质溶胶当中,在那里,被蛋白酶体降解掉。随着在越来越多的病理过程当中发现了内质网质控系统功能缺陷的现象,我们也开始逐渐意识到细胞内这条作用机制的重要性。 在所有人类基因组编码的蛋白质当中,大约有20%的蛋白质被认为是分泌性蛋白质。这些分泌性蛋白质在到达它们的最终的目的地之前都需要先经过内质网的处理,这些目的地广泛分布在细胞各种,例如细胞膜上,各种胞内或胞外的腔室(Exocytotic and endocytotic compartments),以及细胞外表面等等。内质网不仅仅只是提供了一个“容器”,它同时还提供了众多的分子伴侣,帮助蛋白质折叠、成熟。不过虽然细胞提供了这些帮助,蛋白质在合成过程当中仍然非常容易出错。大约有1/3的新生蛋白质会在翻译过程中或者在翻译后数分钟之内被降解掉。这些蛋白质是因为在转录过程、翻译过程、成熟过程或折叠过程中出现了某些错误,或者各个亚基之间的合成不平衡,从而不能形成正确的构象而被降解的。即使是成熟的蛋白质也会因为各种诸如高能辐射、化学损伤、代谢产物等等环境因素而被损伤。这些损伤蛋白会聚集在一起,也会出现功能障碍,这都会影响到内质网以及细胞内环境的稳态。因此,进化机制赋予了内质网控制蛋白质质量的功能,这套质控系统可以在好几个层面对蛋白质进行监控,维持内质网的完好性。 在蛋白质刚刚合成时它们会通过一个特异性的N连接聚糖(N-linked glycan structure)结构被保护起来,可以免遭降解。随后,那些可能发生错误折叠的蛋白质会被内质网中甘露糖苷酶(mannosidase)生成的一种“聚糖密码(glycan code)”所标记(图1)。然后,锚定在内质网膜上的泛素连接酶会破译该“密码”,需要被降解的蛋白质被转运出内质网,经由泛素化途径被26S蛋白酶体降解掉,该过程也被称为内质网相关的降解途径(ER-associated degradation,ERAD)。发生错误折叠的蛋白质并不是唯一一个进入ERAD系统的底物,ERAD系统还可以调控甾醇合成途径,它可以在甾醇过多的情况下降解掉甾醇合成途径中的限速酶,以此来控制合成速度。 图1 蛋白质在内质网内的降解途径。错误折叠的蛋白质在内质网内被降解掉需要以下几个步骤。首先(步骤1),附着在内质网膜上的泛素连接酶与其他辅助因子一起识别出折叠错误的蛋白质。然后在步骤2所示的错位阶段,蛋白质经由一目前尚不清楚的通道被转运进入胞质溶胶之中。步骤3中,在内质网的胞质溶胶面,底物蛋白被E3泛素连接酶泛素化修饰。最后在步骤4中,在AAA+ ATP酶和Cdc48蛋白的作用下,底物蛋白从膜上被去除掉,进入26S蛋白酶体,被降解处理。 科研人员们最开始借助生化技术和遗传筛选的方法发现了一批ERAD系统的组成单位。不过现在,由于发现了细胞对发生折叠错误的糖蛋白进行降解的途径,大家的目光又都投向了ERAD系统的功能研究方向。在本文中我们将介绍内质网蛋白质控系统是如何能够选择、处理出错的蛋白质,但同时又不会降解掉新生蛋白的机制。因为ERAD途径似乎是非常保守的一条途径,可见于从酵母细胞到哺乳动物细胞等种类众多的真核生物细胞,因此我们选择酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为研究对象,来研究其中的机制,同时这也丰富了我们的知识,又进一步扩展了研究范围(以往只对哺乳动物进行过这方面的研究)。在图2中,我们给出了酵母细胞和哺乳动物细胞中ERAD系统的组成因子,以及这些因子在细胞内的分布情况。 图2 酵母细胞和哺乳动物细胞中的蛋白质降解机制。分子伴侣和糖基水解酶47(glycosylhydrolase-47)家族蛋白Mns1 and Htm1能发现折叠错误的蛋白质,并使其与内质网膜结合连接酶Doa10、RMA1、HRD相结合。当底物蛋白与内质网胞质溶胶面结合后就会被E3连接酶泛素化修饰。所有的泛素连接酶复合体都含有一个重要的含有指环催化结构域的E3连接酶,一个E2结合酶以及其他一些辅助因子蛋白。AAA+ ATP酶Cdc48蛋白能使泛素化修饰的底物蛋白从内质网膜上脱离下来。配体蛋白(adaptor proteins)Rad23 and Dsk2能促使泛素化修饰的底物蛋白进入26S蛋白酶体被降解,同时,Png1蛋白能借助Rad23蛋白的作用使糖蛋白去糖基化。图中酵母蛋白以紫色表示,哺乳动物蛋白以绿色表示。 图3 内质网中的蛋白质处理途径。蛋白质经由Sec61蛋白被转运入内质网中之后(如图中步骤1所示),未折叠的蛋白质在分子伴侣的作用下可以被折叠成正确的构象F,如图中步骤2所示。外向转运因子能选择这些折叠正确的蛋白质并将它们运送至高尔基体,如图中步骤3和4所示。而滞留因子则会阻止未折叠的蛋白质离开内质网,如图中步骤5所示。分子伴侣会努力帮助任何折叠发生错误的蛋白质恢复成未被折叠的状态,使其能够重新进行正确的折叠,如图中步骤6所示。在步骤7中,滞留因子会使折叠错误的蛋白质停留在内质网中,最终,这些异常蛋白质以及一部分处于折叠中间状态的蛋白质会经胞质溶胶途径被降解,如图中步骤8所示。KU→F和KU→M表示反应的平衡常数。
背景知识1:关于蛋白质外向转运的灵活标准
大部分在内质网中合成的蛋白质多肽都会被N连接低聚糖(N-linked oligosaccharides)修饰。低聚糖糖基转移酶(Oligosaccharyltransferase)能催化葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖(glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharides)与进入内质网蛋白所含的Asn-X-Ser/Thr基序中的天冬酰胺(asparagine)之间共价连接(图4)。这些N连接聚糖赋予了被修饰蛋白更多的亲水性,同时也能起到帮助蛋白质折叠的作用。而且,这些聚糖分子结构本身的修饰信息也能为我们提供当下的蛋白质的折叠状况信息。聚糖分子最外侧的两个葡萄糖分子会被内质网中的α葡萄糖苷酶(α-glucosidases)水解切除掉,以表明该蛋白正处于折叠过程之中(图4)。在这个阶段,葡聚糖依赖的分子伴侣蛋白会与该蛋白相连。在哺乳动物细胞中,钙联接蛋白(calnexin,是内质网中的一种磷酸化的钙结合蛋白)或钙网织蛋白(calreticulin)会与单葡糖基化修饰的糖蛋白(monoglucosylated glycoproteins)相连接,帮助其成熟。当新生蛋白与这些伴侣蛋白分子解离之后,内质网内的α葡萄糖苷酶II(α-glucosidase-II trims)分子会去掉残余的葡萄糖分子,防止新生蛋白再次与钙联接蛋白或钙网织蛋白相连。这些进行了正确折叠获得天然构象的糖蛋白随后就可以离开内质网了。 但是那些需要更多帮助才能成熟的蛋白质又是如何获得正确构象的呢?作为哺乳动物细胞内质网内最主要的折叠装置,UDP葡萄糖(UDP-glucose)糖蛋白葡萄糖基转移酶(glycoprotein glucosyltransferase,GT或者叫UGGT)能识别出非天然蛋白质,并使其聚糖分子A分支重新葡萄糖基化,这样,就可以再次与钙联接蛋白或钙网织蛋白相连,进行重新折叠(图4b)。这种钙联接蛋白-钙网织蛋白循环(calnexin–calreticulin cycle)只是哺乳动物细胞内蛋白质质控系统里的第一步,但是如果新生蛋白“错过”了这一轮成熟的机会,就只能被降解掉。 图4 在酵母细胞和哺乳动物细胞内质网中对N连接聚糖分子的处理过程示意图。a:在酵母细胞和哺乳动物细胞中,寡糖基转移酶(oligosaccharyltransferase,OST)能将多萜醇载体上的葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide)转移到底物蛋白Asn-X-Ser/Thr基序中的天门冬酰胺残基上。在酵母细胞中葡萄糖苷酶1、2(glucosidases 1 and 2,Gls1、Gls2)能将葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子中最外侧的两个葡萄糖残基去除掉,形成葡萄糖1-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(glucose1-mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide),如图中步骤1所示。在Gls2蛋白的继续作用下最终能形成甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(mannose9-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide),该分子能保护糖蛋白免遭降解,见步骤2。Mns1蛋白能去除聚糖分子B链,即中间链上最外侧的甘露糖残基,形成甘露糖8-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(mannose8-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide),这说明该糖蛋白在内质网中停留了很长的一段时间,见步骤3。然后,Htm1蛋白继续处理最右手边的C链糖蛋白,形成甘露糖7-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(mannose7-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide),见步骤4;b:在哺乳动物细胞中,步骤1和2与酵母细胞中发生的相同,只不过在步骤2中由葡萄糖苷酶II(glucosidase-II)完成的去除A链中最后一个葡萄糖残基位点的反应是可逆的。葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase,GT)能促使那些未能获得天然构象的糖蛋白再次发生葡萄糖基化,见步骤3。如果EDEM蛋白被ERManI进行过度的去甘露糖基化处理或者被内质网降解,都会形成甘露糖5-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(mannose5-N-acetylglucosamine2 oligosaccharide),而这就是蛋白质应该被降解的信号,见步骤4。
2. 给予降解信号 因为Mns1蛋白是不考虑蛋白的折叠状态,对所有蛋白“一视同仁”的,由此可见,仅仅只靠8甘露糖结构是不足以促使糖蛋白降解的,一定还有其他的信号机制帮助细胞区分正常的蛋白与异常的蛋白。我们最开始认为Htm1蛋白只是一种凝集素蛋白(lectin)。但现在我们认为,糖蛋白在经过Mns1蛋白处理之后,Htm1蛋白可以去除掉N连接聚糖C链上的α1,2甘露糖帽结构(capping α1,2-mannose),不过我们目前还缺乏这方面的直接证据。因此,Mns1蛋白和Htm1蛋白之间的这种序贯作用最终就形成了甘露糖7-N-乙酰葡糖胺酶2结构(mannose7-N-acetylglucosamine2),这种结构就是被ERAD所识别的信号。上述这种理论也可以解释为什么细胞缺失了编码α1,3甘露糖转移酶(α1,3-mannosyltransferase,Alg3)的基因之后细胞就可以在不需要Htm1蛋白的情况下仍然能对糖蛋白进行降解了。我们在Δalg3细胞中发现,在N连接聚糖糖蛋白上有甘露糖5-N-乙酰葡糖胺酶2结构(mannose5-N-acetylglucosamine2)结构,该结构的末端仍然连接有由Htm1蛋白导致的α1,6甘露糖残基。Htm1蛋白是如何选择底物的我们还不清楚。不过Htm1蛋白可以和二硫化物异构酶(disulphide isomerase)Pdi1蛋白一起形成复合体,因此,Htm1蛋白可能只能对与氧化还原酶(oxidoreductase)有关的Pdi1蛋白的底物发挥作用。 在哺乳动物细胞中,我们在内质网中发现了GH47家族蛋白中的四名成员,即内质网α1,2甘露糖苷酶1(ER α1,2-mannosidase-I,ERManI)和其他三个甘露糖苷酶样蛋白EDEM1、EDEM2、EDEM3。ERManI蛋白与它在酵母细胞中的同源蛋白一样,也能水解α1,2甘露糖苷键,切掉B链上的一个甘露糖残基。内质网中ERManI蛋白的丰度能影响ERAD系统底物的稳定性。如果使用siRNA技术敲除掉ERManI蛋白,就会影响未被切割的无唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor)H2a蛋白前体的降解过程。如果过表达ERManI蛋白,则会增强去甘露糖基化作用(de-mannosylation),降解掉α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin)的无效香港变异体蛋白(null Hongkong (NHK) variant)。 不过在酵母细胞中,仅靠ERManI蛋白还不足以对糖蛋白进行标记,使其降解。似乎ERManI蛋白还需要与EDEM家族蛋白共同作用才能处理掉异常的糖蛋白。虽然我们过去认为EDEM蛋白只是凝集素而已,但是现在已经年有证据表明EDEM家族蛋白与Htm1蛋白一样,都是甘露糖苷酶。细胞内EDEM1和EDEM3蛋白过表达时,连接在底物蛋白,诸如NHK、BACE451、T细胞受体α亚单位上的葡聚糖分子中甘露糖残基的数量就会减少。此外,根据我们对EDEM蛋白结构模型的分析,我们发现EDEM蛋白与ERManI蛋白在结构上具有惊人的相似性,而且还发现对于ERManI蛋白催化活性比较重要的氨基酸残基都非常保守。这说明至少EDEM1和EDEM3蛋白具有甘露糖苷酶的活性。不过我们还不清楚这些酶是如何选择各自底物的。但是我们知道EDEM1蛋白能与钙联接蛋白发生相互作用,因此,它可能借此方式来与底物糖蛋白发生相互作用。 3. ERAD系统的分类整理功能
3.1 针对各种不同异常情况的蛋白需要不同的途径给予解决 3.2 酵母细胞中ERAD系统的关键信息 HRD复合体是依靠何种机制选择出那些机体不需要的异常蛋白,将其“清理”出内质网的呢?我们又提出了下列机制,在Kar2的作用下,非天然构象的蛋白质与HRD连接酶发生相互作用,最终,这些非天然构象的蛋白质可能会形成成熟的,具有正确折叠构象的蛋白质,或者仍然无法形成正确构象。然后,Hrd3蛋白可能会通过底物蛋白中的疏水结构与底物蛋白结合,同时,Yos9蛋白会对这些底物蛋白进行筛查,检查它们是否具有末端α1,6连接甘露糖(α1,6-linked mannose)。只有能同时与Yos9蛋白和Hrd3蛋白发生相互作用的底物蛋白才能在携带有甘露糖8-9聚糖分子(mannose8–9 glycans,这些糖基化位点可以被切除,帮助蛋白质形成正确的折叠)的糖蛋白的帮助下,经由Hrd1蛋白被泛素化途径修饰。 如果在细胞内缺乏Yos9蛋白和Hrd3蛋白的情况下过量表达Hrd1蛋白,会导致内质网内的蛋白广泛性降解,这说明Yos9蛋白和Hrd3蛋白能起到筛选的作用,以保证只有合适的底物才能进入胞质溶胶经由泛素化途径被降解。为了达到这个目的,Hrd1蛋白会与可溶性的E2结合酶Ubc1和Ubc7一起协同发挥作用,这些E2结合酶会通过Cue1蛋白被锚定在内质网膜上。 在酵母细胞中第二个位于内质网膜上的E3连接酶是Doa10蛋白,我们是在筛选能够降解可溶性转录抑制因子Matα2的蛋白因子的过程中发现Doa10蛋白的。随后我们又发现了好几个Doa10蛋白的膜上底物蛋白,因此认为Doa10蛋白也参与了ERAD通路。Doa10蛋白在N端具有特征性的指环结构域(RING-finger domains)以及14个跨膜结构域。虽然Doa10蛋白复合体的膜结构如此复杂,但是组成Doa10蛋白复合体的亚单位还是非常简单的,我们现在只发现E2结合酶Ubc6蛋白和Ubc7蛋白是Doa10蛋白的辅因子。Ubc7蛋白是通过Cue1蛋白被锚定在内质网膜上的。 3.3 哺乳动物连接酶 Yos9蛋白在哺乳动物细胞中的另一个同系物(orthologue)就是XTP3-B蛋白,即XTP3反式激活蛋白B(XTP3-transactivated protein B),也被称为Erlectin蛋白。XTP3-B蛋白具有两个MRH结构域,能与SEL1L蛋白发生相互作用。与OS-9蛋白一样,XTP3-B蛋白也能与NHK蛋白及其非糖基化的变异体蛋白相结合。如果过量表达XTP3-B蛋白会影响其底物蛋白的降解过程,不过通过siRNA技术减少XTP3-B蛋白的表达量却没有对NHK蛋白的稳定性造成任何影响。我们还没有发现XTP3-B蛋白的最适底物,XTP3-B蛋白也可以使未成熟的蛋白质滞留在内质网中,并防止它们聚集,这一点与OS-9蛋白过表达时的情况一样。 HRD1蛋白能避免细胞在遭受应急刺激信号时进入凋亡途径,这说明它在内质网异常蛋白的泛素化修饰过程中起到了非常广泛的作用。在目前为止发现的所有HRD连接酶的底物蛋白中,有一些是名为RI332的内质网核糖体结合糖蛋白(Ribophorin)的截短体蛋白和折叠错误蛋白,有一些是未组装的分泌型Igμ单链蛋白以及未糖基化的Igκ轻链蛋白变异体蛋白。在内质网中,这种异常Igκ轻链蛋白处于一种完全氧化的状态,具有两个二硫键(disulphide bonds),而部分还原时只具有一个二硫键。只有这种部分还原的异常Igκ轻链蛋白能与Derlin-1蛋白和HERP蛋白发生相互作用,这表明在完全氧化的Igκ轻链蛋白被连接酶招募之前,已经有一个二硫键被还原了。人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)基因编码产物特异性小区域蛋白11(unique short region protein 11,US11)也能与HRD连接酶复合体的组成单位SEL1L蛋白和Derlin-1蛋白相互合作,降解MHC I类分子重链蛋白。 Gp78蛋白和人HRD1蛋白的跨膜结构域具有超过50%的序列同源性。与需要Cue1帮助才能与Ubc7发生相互作用的Hrd1蛋白不同,gp78蛋白除了环指结构域之外还具有G2BR结构域,该结构域可以与UBE2G2进行结合,因此可以直接招募酵母细胞中Ubc7蛋白的同系物E2 UBE2G2蛋白,即E2结合酶E2G2。在gp78蛋白的底物蛋白中有一个底物是α1抗胰蛋白酶的变异体Pi Z蛋白,还有T细胞受体orphan亚单位,比如TCRα和Cd3δ等。而且,gp78蛋白还能泛素化修饰HMG-CoA还原酶,这说明ERAD系统在固醇代谢途径中的作用非常保守。gp78蛋白还有另一个具有非常重要医疗价值的底物,即KAI1蛋白,该蛋白具有四个跨膜结构域,能够抑制肿瘤转移。如果通过siRNA降低gp78蛋白的表达水平,会增加细胞内KAI1蛋白的含量,降低肿瘤细胞的转移能力。 Doa10蛋白在哺乳动物细胞中最有可能的同系物就是TEB4蛋白。这两种蛋白都有相同的跨膜结构域和N末端的指环结构域。不过TEB4蛋白可以使其自身泛素化,但是我们还没有发现它的底物蛋白。 除了这些与酵母细胞连接酶相似的连接酶之外,在哺乳动物细胞中还存在一些酵母细胞中没有的ERAD连接酶。内质网中有一种名为携带有膜锚定结构的指环蛋白1(RING-finger protein with membrane anchor 1,RMA1),该蛋白是一种在拟南芥(Arabidopsis)到人类中都广泛存在、非常保守的泛素连接酶。RMA1蛋白能与UBE2J1蛋白相互作用,如果过表达RMA1蛋白会降低细胞内囊性纤维化病跨膜传导调节蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)的水平。RMA1蛋白最主要的作用是在CFTR蛋白翻译过程中或翻译刚刚完成之后检测CFTR蛋白N末端结构域的折叠情况。翻译完成之后,胞质内的E3连接酶CHIP蛋白会促使RMA1蛋白解离,继续检测CFTR蛋白的折叠情况。CHIP蛋白含有一在结构上与指环结构域非常类似的U盒子(U-box)结构域,它是一三角形四肽(tetratricopeptide)重复结构域,能与Hsp70蛋白和Hsp90蛋白发生相互作用。CHIP蛋白这种能与分子伴侣蛋白和泛素连接酶蛋白相结合的活性表明CHIP蛋白能监控Hsp70蛋白介导的蛋白折叠过程,并能降解那些发生了不可逆的错误折叠的蛋白质。 另一个能与RMA1蛋白发生相互作用的蛋白是B细胞受体相关蛋白31(B-cell receptor-associated protein 31,BAP31)。BAP31蛋白是一种膜内在蛋白质(integral membrane protein),它也参与了对内质网内膜蛋白的分选工作。BAP31蛋白能与Sec61孔蛋白、E3连接酶RMA1蛋白、Derlin-1蛋白等发生相互作用。如果通过siRNA技术抑制BAP31蛋白的表达则能够稳定CFTR蛋白,BAP31蛋白还能起到分子伴侣的作用,帮助新合成的CFTR蛋白折叠,还能帮助区分各种不能由RMA1蛋白折叠以及由Derlin-1蛋白降解的变异蛋白。 泛素连接酶蛋白的变异体蛋白Parkin与青少年帕金森氏病(juvenile Parkinson’s disease)有关。如果表达缺陷型的Parkin蛋白可以导致Pael-R蛋白在内质网中聚集,继而导致多巴胺能神经元变性,形成帕金森氏病。在体外,Parkin蛋白可以泛素化修饰Pael-R蛋白,不过效率非常低,但是在CHIP蛋白的帮助下可以大大提高此泛素化修饰效率。 胞质内的SCF复合体是由Skp1蛋白、Cul1蛋白、Roc1蛋白(又名Rbx1蛋白)以及F-Box等蛋白组成的泛素连接酶复合体。在大量的F-Box蛋白中有两个蛋白能够决定SCF连接酶的底物特异性,这两个蛋白是神经元特异性的蛋白Fbs1和Fbs2,它们都是能够识别糖基侧链的F-Box蛋白。Fbs1蛋白和Fbs2蛋白都含有糖基化位点结合结构域,能与N连接聚糖分子中最内侧的糖基化位点相结合。我们目前还没有发现SCF复合体的底物,但它们可以清除那些可能是从经典的ERAD途径中“逃脱”的糖蛋白胞质溶胶或者是在内质网脂质双分子膜破裂时“泄露”出来的糖蛋白。 3.4 跨越内质网膜结构 HRD连接酶将发生在内质网膜两侧的重要事件联系了起来。这两个重要事件分别是在内质网腔内侧发生的底物蛋白募集事件和在内质网胞质侧发生的底物蛋白质泛素化修饰事件。因此,底物蛋白质的外向运输事件可能是通过连接酶中的某种“管道”完成的。可能HRD复合体本身就能将异常的蛋白质“排出”到胞质当中。与HRD连接酶共同发挥作用的还有Derlin家族蛋白,这些Derlin家族蛋白也是最有可能起到转运作用的蛋白质。有3个Derlin家族蛋白与酵母Der1蛋白具有一定程度的同源性,这3个蛋白可以一起组成异源复合体,同时MHC I类重链分子也参与了该复合体的形成。Derlin-1蛋白能与HCMV病毒的US11蛋白发生相互作用。当我们使用抑制剂抑制蛋白酶体活性的时候,我们发现Derlin-1蛋白与去糖基化的重链分子结合在一起。而胞质中的N聚糖酶(N-glycanase)能去除掉MHC I类重链分子上的糖基化位点。因此,Derlin-1蛋白肯定是在重链分子被转运至胞质中之后或者在转运过程之中才与其结合的。我们还发现具有各种不同功能的ATP酶,比如AAA+-ATPase p97蛋白(即酵母细胞中的Cdc48蛋白)等能够与Derlin-1蛋白和Derlin-2蛋白发生相互作用,这也都说明Derlin蛋白能够起到转运内质网中异常蛋白的作用。我们在下面还将讨论到,Cdc48蛋白能促使ERAD系统底物锚定到内质网膜上。Derlin-1蛋白不参与US2蛋白介导的重链分子降解过程,因此它可能还会起到其他的作用,或者在内质网中还存在其他的转运机制。 3.5 底物蛋白从内质网膜结构上释放出来并被降解破坏 当底物蛋白被泛素化修饰并从内质网膜结构上解离下来之后,它们会在辐射敏感蛋白23(radiation sensitive 23,Rad23)和Kar1蛋白抑制蛋白(ominant suppressor of Kar1,Dsk2)的作用下被转运至蛋白酶体。这些同源性适配体蛋白的C末端都具有泛素相关基序(ubiquitin-associated motif,UBA),能与多泛素蛋白链相结合,同时也在N端具有一泛素样结构域(ubiquitin-like domain,UBL),能指引适配体蛋白和底物蛋白进入蛋白酶体,蛋白酶体可以通过Rpn10和Rpn13亚单位识别多泛素化修饰的底物蛋白。此外,Dsk2蛋白和Rad23蛋白还可能保护多泛素蛋白侧链免遭泛素蛋白水解酶的降解作用。在这条经典的途径中,E3连接酶能多泛素化修饰底物。在酵母细胞中还有第二条途径,底物蛋白首先在连接酶的作用下被单泛素化修饰或者被双泛素化修饰,然后在U-Box蛋白Ufd2和Cdc48蛋白的作用下延长泛素链。Cdc48蛋白能限制Ufd2蛋白对泛素链的延长作用,因为Ufd2蛋白能添加4至6个泛素蛋白,这已经足以供Rad23蛋白和Dsk2蛋白进行识别了。这种泛素修饰侧链的延长作用可能就起到了指引底物蛋白进入蛋白酶体的作用。 因为N聚糖酶能与Rad23蛋白发生相互作用,也有可能与其他ERAD组成单位发生相互作用,因此糖蛋白在到达胞质时就会失去寡聚糖修饰分子。不过该过程对蛋白的降解过程不会产生影响,但是去掉了这些大分子侧链之后会促进底物蛋白进入蛋白酶体中的活性位点。在被蛋白酶体降解之前,去泛素化酶会去除掉底物蛋白上的泛素修饰分子,这些泛素修饰分子随后会被再循环利用。 5. 未来的发展方向
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