Plus深读 | LGR通过激活Wnt信号通路来调控胃癌细胞的增殖和侵袭

河北大学的 Wang等近期在Oncogenesis 上发表文章[1]，报道了他们近期在胃癌细胞中的研究成果，证实LGR5通过激活Wnt/β-Catenin信号通路推动了胃癌演进。他们发现LGR5的过表达和敲减分别上调和下调了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而C59（Wnt抑制剂）和Wnt3a（Wnt激活剂）的处理可部分拮抗被LGR5表达影响的胃癌细胞行为。这反映了LGR5和Wnt在癌细胞增殖中存在信号交互。此外，LGR5促进了Wnt 信号通路下游标记物β-Catenin在细胞核中的累积及其靶基因的转录，明确了LGR5对该通路的部分作用。LGR5过表达增加了肌动蛋白微丝和伪足形成，提升了癌细胞的移动能力。Wang等证实了上述作用同样是通过Wnt通路实现的。这些癌症发生发展的分子机制研究，将有助于推进精准化医疗，为患者带来福音。

LGR5 （leucine-rich G-protein-coupled receptor 5）是一种G蛋白偶联受体，属于糖蛋白激素受体家族。它在胃肠系统的组织发育和成年干细胞维持中起重要作用，常作为干细胞的生物标记 [2] 。LGR5被认为与许多癌症的演进和转移等有关，目前针对它的研究多集中在结直肠癌 [3] 。Wnt是一条被广泛研究的、对β-Catenin起稳定作用信号通路，它促进癌细胞增殖和侵袭，在多种癌症中均有异常的高度激活 [4]。LGR5常被认为是Wnt通路的一个响应元件，但它对癌细胞行为的调控方向存在一定争议性，Wang等结果支持了LGR5是胃癌细胞增殖和迁移的一个正调节因子。

该文主要结果

1. LGR5的表达影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。

LGR5的基因过表达和敲减分别正、反向调节了胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。作者采用了两条胃癌细胞系，并首先通过Western Blot测试和确证了载体在控制LGR5表达上有效性：SGC7901-LGR5 和BGC823-LGR5显著提高LGR5表达，SGC7901-shRNA-LGR5 和 BGC823-shRNA-LGR5显著削弱LGR5表达。随后，集落形成实验和MTT测试表明，LGR5过表达显著增加了胃癌细胞增殖，LGR5的瞬时和长期抑制均显著减少了胃癌细胞增殖。划痕实验证明LGR5过表达和敲减分别显著提高和降低了两种胃癌细胞的迁移率。Matrigel侵袭实验则表明LGR5过表达可将两种胃癌细胞侵袭率分别提高至1.38和1.81，LGR5敲减则将侵袭率降低至0.44和0.46。

图：LGR5基因过表达和敲减分别对胃癌细胞增殖的正、反调节作用。

图：LGR5表达对胃癌细胞迁移的影响

图：LGR5信号调整对胃癌细胞侵袭的影响

2. LGR5通过Wnt/β-Catenin信号通路调节胃癌细胞的增殖和迁移

作者采用了Wnt通路的抑制剂和激活剂来调控通路，并进一步确证该通路与LGR5的关系。在LGR5过表达的两种胃癌细胞中，使用Wnt抑制剂C59可显著减少细胞增殖。在LGR5基因敲减的胃癌细胞中，Wnt3a对 Wnt通路的激活则一定程度地恢复了细胞增殖。关于细胞迁移的实验也得到类似结果。上述研究表明LGR5通过Wnt信号通路推进胃癌细胞增殖和迁移。

图：LGR5通过Wnt信号通路调控两种胃癌细胞增殖和迁移

进一步研究LGR5对下游β-Catenin的影响时发现，LGR5的过表达增加了Wnt信号通路核心元件——β-Catenin在细胞质和细胞核的累积水平，LGR5的敲减则相反。LGR5诱导了β-Catenin向细胞核迁徙，增加了β-Catenin下游基因Axin2 和 TCF1的表达。此外，Wnt抑制剂C59显著拮抗了LGR5对上述两个基因的上调。β-Catenin在细胞核的积累和下游基因的转录激活是癌症演进的重要一环。LGR5调节了β-Catenin的表达和向核迁徙，通过Wnt/β-Catenin信号通路参与了胃癌细胞行为的调控。

图：LGR5调节了β-Catenin的表达、定位及下游基因转录水平。

3. LGR5过表达和敲减对细胞形态及流动性的影响

细胞骨架是高度动态的结构，Wnt信号通路调控细胞形态学上的变化和细胞运动。镜检发现，LGR5过表达使得圆形的胃癌细胞拉长成类似于成纤维细胞的形态，作者将这种形态的细胞命名为梭形细胞。梭形细胞在LGR5过表达细胞系中的比率显著高于LGR5敲减细胞系和空白对照。而分别采用Wnt抑制剂C59处理LGR5过表达细胞和Wnt激活剂Wnt3a处理LGR5敲减细胞，均可将梭形细胞恢复成正常表型，证明LGR5通过Wnt通路调节细胞形态。

通过肌动蛋白染色实验发现，LGR5过表达的细胞形成了大量肌动蛋白微丝和伪足，而LGR5敲减的细胞则维持原状、几乎没有肌动蛋白重塑。伪足计数量化了这一结果：LGR5可能通过触发微丝结构的变化促进细胞运动。Wnt抑制剂C59和激活剂Wnt3A可分别拮抗LGR5过表达和敲减对肌动蛋白重塑的影响。由此推断，LGR5对肌动蛋白重塑的调节是通过Wnt通路实现的。

图：  LGR5过度表达导致的形态学变化

讨论：

LGR5是干细胞的标志，并通过Wnt通路来参与癌症演进的调控。LGR5在其它癌症演进中的调控方向存在争议（与癌细胞种类、状态等相关）。Wang等的研究通过得到确证的LGR5过表达和LGR5敲减技术，利用多个癌细胞行为模型，发现LGR5促进了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。该结果支持了LGR5促进癌症演进的观点，与许多其它癌症中的结果类似，可帮助解释LGR5阳性肿瘤的转移远多于LGR5阴性肿瘤的现象。Wnt信号通路抑制剂和激活剂的使用证明了LGR5是通过Wnt通路来调控胃癌细胞行为的。此外，LGR5从表达和向核移动两个方面都影响了Wnt通路的核心参与因子β-Catenin，该因子对激活癌细胞骨架的重塑和细胞迁移至关重要。LGR5对β-Catenin下游基因、细胞形态和细胞流动性的影响，以及被Wnt信号通路调节因子拮抗的情况，进一步佐证了LGR5是通过Wnt/β-Catenin通路发挥作用的。该文对LGR5推进胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用、以及与Wnt/β-Catenin通路的交互给出了明确的证据，但LGR5对Wnt通路调控的许多分子细节仍待进一步深入研究，例如对Wnt通路的各调节蛋白的具体影响，是否在上游实现交互、如何实现交互，以及阐明LGR5在癌症演进方向上的争议性：在哪些癌症种类、癌细胞状态、LGR5表达水平下为正向/负向调节作用。分子机制的精准化阐明将为癌症诊断标记物和治疗靶标的筛选提供有效依据。

小结

作者对LGR5在胃癌演进中扮演的角色及其对Wnt通路的影响进行了多方面逐层推进的研究，结果表明LGR5推动了胃癌细胞的增殖、转移和侵袭，其分子机制是依赖Wnt/β-Catenin通路实现的，Wnt通路的抑制剂和激活剂可调控LGR5的作用。LGR5诱导了β-Catenin的表达、向核迁徙以及下游基因转录。LGR5对胃癌细胞的形态和流动性有影响，该影响同样通过Wnt信号通路实现。该文为LGR5的过表达和Wnt的激活在胃癌诊断中的潜在作用提供了第一手资料，也为今后进行基于信号通路交互的癌症分子机制研究提供了方法学借鉴。

参考文献

[1] Wang et al. LGR5 regulates gastric adenocarcinoma cell proliferation and invasion via activating Wnt signaling pathway. Oncogenesis (2018) 7:57.

[2] Nick Barker et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature, 2007, 449: 1003–1007

[3] Mariko Shimokawa et al. Visualization and targeting of LGR5+ human colon cancer stem cells. Nature, 2017, 545: 187-192

[4] TAIPALE J, BEACHY P A. The Hedgehog and Wnt signalling pathways in cancer. Nature, 2001, 411: 349-354.