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撰文丨程 伟（博士） 责编丨迦 溆 继microRNA等小短链非编码RNA之后，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）成为了目前生物医学研究的前沿分子。这一潮流萌芽于人类基因组计划发现93%的人类基因组DNA序列可以转录成RNA以及FANTOM联盟报道小鼠基因组也存在广泛转录【1，2】。这些RNA中只有极少数分子能够翻译成蛋白质。然而当时对这些不能编码蛋白的RNA是转录噪音还是功能性分子存在争议。直到2007年Howard Chang报道lncRNA 分子HOTAIR能够功能性的抑制染色质激活【3】，正式将lncRNA研究带入了公众视野（尽管存在争议，但是对领域的推动作用非常巨大，详见此前BioArt的报道：论文重复再起波澜丨那些年，热门的LncRNA（HOTAIR）真的重要吗？）。 实际上lncRNA的研究在全基因组测序出现之前的上个世纪九十年初就早已开始。其中的代表性分子是控制X染色体失活的lncRNA 分子Xist【4】。众所周知，雌性哺乳动物细胞拥有两条X染色体，其中的一条会在胚胎发育过程中失活，从而避免了两条染色体同时激活引起的基因表达剂量效应。Xist仅在失活X染色体（inactive X，Xi）中转录表达并覆盖到Xi染色体特定区域再通过招募Polycomb repressive complex 2 （PRC2）实现X chromosome inactivation （XCI）。作为lncRNA研究的先驱性分子，Xist 无疑为方兴未艾的lncRNA研究提供了丰富的研究思路和方向【5】。 2002年，哈佛医学院博士后Job Dekker发明了Chromosome Conformation Capture（3C）技术证明染色体上相距很远的位点能够在空间上发生相互作用，从而提出了染色体三维结构（3D genome）的概念【6】。这项技术的发明引领表观遗传学进入了立体多维时代。（Job Dekke也因在3D genome领域开创性的研究入选了霍华德休斯医学研究所 （HHMI）。2017年美国国立卫生研究院（NIH）亦资助了一个研 究染色体三维结构的专门计划https://www./）。 目前对3D genome的研究发现，细胞内的染色体并非无规则的排列，而是形成多个相对固定的拓扑结构域（Topologically associating domain，TAD）【7】。按照内部基因的表达与否，TAD可以粗略的划分为活性结构隔室（active compartment or A compartment）和失活结构隔室（inactive compartment or B compartment）。在隔室内部，组蛋白呈现较为一致的修饰模式。但TAD的形成以及调控基因表达的机制还远不清楚。 借助染色体三维结构研究工具，近年来的XCI研究在新的维度上取得了巨大的进展。研究发现，Xi染色体与活性X染色体（active X，Xa）的三维结构差别巨大。Xi染色体呈表面光滑的球形结构，而Xa染色体结构更扁平并且表面更加不规则。Xi染色体内部压缩更紧密，会形成2个相互独立的亚结构域（megadomain），而Xa染色体则只有一个大的结构域（图1）【8】。 图1： Xi染色体三维结构。来源：Teddy Jégu, Eric Aeby & Jeannie T. Lee, Nature Reviews Genetics volume 18, p377–389 (2017) 在胚胎干细胞发育早期，两条X染色体均处于激活状态直至囊胚发育晚期（late blastocyst stage）。同样的两条X染色体如何在胚胎干细胞分化过程中构建出两种完全不同的染色体三维结构和基因表达谱系就成了一个多领域共同关心的问题。美国国家科学院院士，HHMI研究员Jeannie T. Lee近日在Cell上发表文章为这一问题提供了答案（图2）。 图2：SMCHD1介导X染色体隔室形成及X染色体沉默 Jeannie T. Lee长期从事XCI研究，做出了系列重要的工作，发现了多个参与XCI的蛋白质分子和lncRNA【8】，去年她还公开在Science杂志质疑Mitch Guttman组发表的关于LncRNA Xist调节X染色体沉默新机制的Science论文（神仙打架：LncRNA Xist调节X染色体沉默新机制的发现与争论）。在本项研究中，她以参与染色体三维结构调控的structural-maintenance-of-chromosomes （SMC）家族蛋白SMCHD1为切入点， 深入研究了SMCHD1如何与Xist相互协作共同调控Xi染色体三维结构改变，从而实现Xi染色体的基因沉默。和她以往的报道一样，本篇文献再一次示范了高水平研究中如何以单个基因为统一视角揭示一个完整的生物学动态变化过程。 Jeannie T. Lee，HHMI研究员、美国科学院院士、哈佛医学院教授 在确定了SMCHD1共定位于Xi染色体之后（图3），他们利用CRISPR构建了Smchd1 敲除的胚胎干细胞（Smchd1-/- cell）。测序发现在230个本该沉默的Xi基因中有73个随着Smchd1的敲除而沉默失败（图3）。这一发现表明SMCHD1对于Xi染色体基因的沉默至关重要。 图3：SMCHD1定位Xi染色体并调节Xi染色体基因表达 进一步的实验发现，尽管Smchd1的敲除并不影响Xi染色体的整体H3K27m3水平，但却在局部区域干扰了Xi 异染色质的分布和扩散（heterochromatin spreading）（图4）。鉴于Xist介导Xi异染色质的扩散，不难推断Smchd1的敲除很有可能会对Xist的定位造成影响。事实也确实如此，Smchd1-/- cell中Xist在Xi染色体上的覆盖范围大大降低了（图4）。这也是Xi染色体基因的沉默失败的主要原因。 图4: SMCHD1调节H3K27me3及Xist分布 为了进一步研究SMCHD1调控Xi染色体基因表达的机制，作者回归了SMCHD1蛋白本身的功能：调控染色体三维结构。利用衍生自3C的Allele-specific Hi-C技术，他们在Smchd1-/- cell中发现了Xi染色体三维结构发生了巨大改变。对照细胞中Xi染色体形成了以Dxz4基因为边界的双megadomain结构，而在Smchd1-/- cell里，Xi染色体的megadomain内部出现了未曾报道过的隔室结构（Compartment）（图5）。 图5: SMCHD1调节Xi染色体三维结构 进一步的统计发现Smchd1-/- cell的Xi染色体多出了26个新的隔室。按照基因的激活状态，作者将这些隔室划分为两类：S1（激活性隔室）和S2（失活性隔室）。更有意思的是Xist主要聚集在S1区域（图6）。这一系列结果表明Xi染色体中Xist集中分布的染色体区域和较少分布的染色体区域形成了相互独立的隔室。而SMCHD1的功能则在于将这两类隔室融合。这也是以往研究并没有发现这两类隔室的原因。 图6: SMCHD1调节Xi染色体隔室融合 除此以外，他们利用更高灵敏度的原位Hi-C发现Xi染色体并非像传统认为的那样缺少TAD结构，而是形成了较弱的TAD结构。Smchd1的敲除则可以大大增强Xi染色体的TAD结构（图7）。 图7: SMCHD1调节Xi染色体TAD结构 在分子层面，Smchd1-/- cell中Xi染色体上CTCF和RAD21的结合显著增强。这也解释了其TAD结构增强的现象（图8）。 图8: SMCHD1调节CTCF及RAD21的Xi染色体结合 为了进一步确认SMCHD1参与S1/S2隔室融合，作者使用DamID技术【9】首先获得一个细菌adenine methyltransferase （Dam）与SMCHD1融合的变体蛋白（Dam- SMCHD1），并利用Dam的甲基转移酶活性标记与SMCHD1结合的DNA序列中的GATC序列中的Adenine来精确定位SMCHD1的结合位点（需要指出的是DamID技术的一个基本假设是哺乳动物细胞内不存在DNA的adenine methyltransferase，而这一点随着何川等发现低等真核生物DNA也可以发生adenine甲基化而在将来可能遭到挑战。）。DamID结果表明，SMCHD1广泛结合于S1和S2隔室内部的染色质上，仅在S2隔室内部呈现稍高的富集（图9）。这一点表明SMCHD1通过与S1/S2隔室内部染色质的广泛结合来实现S1/S2隔室融合。
图9: SMCHD1广泛结合于Xi染色体隔室结构内 由于S1/S2隔室存在于Smchd1-/- cell中，这两类三维结构是否天然存在仍不清楚。为了回答这个问题，他们以野生型雌性ES细胞为分化模型进行了更为细致的XCI过程研究。结果表明ES细胞分化4-7天内，Xi染色体的确出现了更多隔室结构。这一结构会在ES细胞完成分化后消失（图10）。
进一步的分析表明，野生型ES细胞在分化早期的确出现了Smchd1-/- cell中存在的S1/S2隔室结构（图11）。综合这些结果，S1/S2隔室的确是XCI过程中天然存在的一种过渡性三维结构。
图11: Xi染色体在沉默过程中出现过渡性隔室结构与SMCHD1中出现的结构类似 综合以上所有证据，一个更为详细完整的XCI过程呈现在我们面前（图12）。在XCI开始前，两份X染色体均处于活性转录。位于A compartment内Xist的表达启动了XCI。它覆盖到Xi上特定区域后，导致Xi染色体形成S1和S2两类过渡状态隔室。此时Xi并未完全沉默。SMCHD1随即被招募到S1和S2内部并促进S1和S2两类隔室融合从而实现全染色体大范围基因沉默最终完成XCI全过程。 缺少SMCHD1的细胞则导致S1/S2隔室融合失败而无法实现Xi染色体正常沉默。 图11: SMCHD1参与XCI机制 相关阅读： 神仙打架：LncRNA Xist调节X染色体沉默新机制的发现与争论 参考文献 1. International Human Genome Sequencing, C. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431, 931-945 (2004). 2. Kawai, J., et al. Functional annotation of a full-length mouse cDNA collection. Nature 409, 685-690 (2001). 3. Rinn, J.L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell 129, 1311-1323 (2007). 4. Brown, C.J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature 349, 38-44 (1991). 5. Lee, J.T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol 12, 815-826 (2011). 6. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M. & Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science 295, 1306-1311 (2002). 7. Bickmore, W.A. & van Steensel, B. Genome architecture: domain organization of interphase chromosomes. Cell 152, 1270-1284 (2013). 8. Jegu, T., Aeby, E. & Lee, J.T. The X chromosome in space. Nat Rev Genet 18, 377-389 (2017). 9. Vogel, M.J., Peric-Hupkes, D. & van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc 2, 1467-1478 (2007). 本文转载自： |
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