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原文链接： http://pmo347760.pic31./upload/s41467-018-04250-4.pdf 背景介绍 转录后修饰在RNA结构和功能中发挥着重要的作用。迄今为止，在各种RNA中鉴定出超过130种类型的RNA修饰。转移RNA（tRNA）含有多个修饰，涉及tRNA三级结构的稳定化和对遗传信息的精确解码。多种RNA修饰存在于tRNA的反密码子区域，它们对蛋白质翻译准确性的起着关键作用，包括氨酰化，解码和易位等。线粒体是真核细胞中通过呼吸链产生ATP的细胞器。在哺乳动物线粒体中，线粒体基因组编码产生ATP所需的22种tRNA。在5个物种的线粒体tRNA（mt-tRNA）中发现tRNA的第37位存在N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷以及其衍生物（t6A37）的修饰（Fig1a），它负责翻译以A开头的密码子（ANN）。tRNA修饰的缺失与线粒体功能障碍引起的人类疾病密切相关，但是至今为止，哺乳动物线粒体中t6A37的生物合成以及功能并不清楚。 文章概括 在这篇文章中，研究人员通过从MERRF样患者细胞中分离出的突变型mt-tRNA中发现低水平的t6A37，表明缺乏t6A37会导致病理结果。并发现了t6A37受细胞内CO2 /碳酸氢盐浓度的调节，这意味着线粒体翻译在生理条件下以密码子特异性方式调节。 在这篇文章中，研究人员还证实tRNA修饰或tRNA修饰酶的缺失与线粒体功能障碍引起的人类疾病密切相关；且缺乏两种类型含牛磺酸的修饰——5-牛磺酰基甲基尿苷（τm5U）和5-牛磺基甲基-2-硫尿苷（τm5s2U），会导致线粒体翻译缺陷、线粒体功能障碍相关的病理学结果。同时表明了t6A37在tRNA的氨基酰化和防止起始密码子的漏泄扫描和终止密码子的读取中也起关键作用，且YRDC和OSGEPL1是5种mt-tRNA中t6A37形成的关键基因。 研究结果 1.YRDC参与t6A37在线粒体中的形成。 YRDC（Uniprot：Q86U90）是YrdC / Sua5的人类同源物，催化TC-AMP的形成。 为了检查人类YRDC的亚细胞定位，研究人员在HeLa细胞中瞬时表达C末端FLAG标记的YRDC，并通过免疫染色检测标记蛋白质。 研究人员从表达YRDC-FLAG的HEK293T细胞中分离线粒体部分，并与全细胞裂解物一起进行western印迹作为对照证实了YRDC具有N末端线粒体靶向序列（MTS）（补充图a和图c），意味着线粒体定位。并推测YRDC第10位的Met作为该细胞系中细胞质YRDC产生的替代起始位点。否则，如果YRDC的线粒体定位完全受到+1移码突变的损害，细胞质YRDC产生的TC-AMP可能通过穿透线粒体膜进入线粒体，并用于线粒体t6A37形成。 2.OSGEPL1参与线粒体t6A37的形成。 研究人员检测了在HeLa细胞中瞬时表达的C-末端FLAG标记的OSGEPL1的亚细胞定位。如图a所示，OSGEPL1主要位于线粒体中。与此一致，iPSORT分析预测OSGEPL1的N-末端区域中存在MTS。当OSGEPL1-KO细胞被质粒编码的OSGEPL1拯救时，t6A37水平部分恢复（图e）。相比之下，t6A37不被MTS截短的OSGEPL1（a.a.Δ2-33）拯救（图e），表明由MTS介导的线粒体定位对mt-tRNA中t6A37形成是必需的。 3.OSGEPL1的缺失导致线粒体功能障碍。 通过监测在含有半乳糖培养基中的细胞生长可以评估OSGEPL1-KO细胞的线粒体活性。OSGEPL1-KO细胞在葡萄糖培养基中生长略慢于WT细胞（图a），但在半乳糖培养基中表现出严重的生长缺陷（图a），表明OSGEPL1KO细胞中的线粒体功能障碍。 接下来通过酸 - 尿素Northern印迹法测量mt-tRNA中的氨酰化水平（图g）。研究人员观察到在OSGEPL1-KO细胞中没有改变没有t6A37的氨酰-mt-tRNA。 这个发现表明t6A37是mt-tRNA在人类线粒体中高效氨酰化所必需的。 为了确定OSGEPL1-KO细胞中5种mt-tRNA的稳态水平，研究人员进行了Northern印迹，但没有发现任何这些tRNA水平的显着变化，表明缺乏t6A37几乎对tRNA的稳定性没有影响。 4.线粒体t6A37的体外重建。 通常，来自生命各个领域的大多数tRNA具有高度保守的分子内三级相互作用，包括促进折叠成L形三级结构的D环/ T环“亲吻”相互作用。 然而，大多数哺乳动物mt-tRNA缺乏这种D环/ T环相互作用，而是采用非经典的三叶草结构。 实际上，含t6A37的mt-tRNA中D / T环的大小和序列变化很大（图b）。 特别是，mt-tRNASer（AGY）缺乏整个D臂。为了确定OSGEPL1如何识别这些具有不同结构的mt-tRNA，研究人员建立了线粒体t6A37形成的体外重建系统并检查了它的底物特异性。 研究人员从OSGEPL1-KO细胞中分离出缺少t6A37的个体mt-tRNAIle和mt-tRNASer（AGY），并在体外在这些tRNA中检测了t6A37的形成。这些发现表明，人类OSGEPL1进化获得了广泛的底物特异性，以适应至少5种具有不同结构的mt-tRNA。我们发现了几种YRDC的不同N端异构体。它们都显示出有效的活性，三种异构体之间几乎没有显着差异 5.致病性突变损害线粒体t6A37形成。 鉴于t6A37在线粒体蛋白质合成中起关键作用，研究人员推测mt-tRNA基因中的一些致病性点突变损害t6A37形成，继而导致线粒体功能障碍。从先前描述的致病性突变中，研究人员通过体外转录为Thr，Lys和Asn制备了21个突变型mt-tRNA，然后检测了它们经YRDC和OSGEPL1介导的t6A37修饰的能力（图c） 。正如所料，mt-tRNA中的两个靶点突变A8326G和mt-tRNA中的A5693G完全消除了t6A37的形成。 三个mt-tRNA基因中的21个致病性点突变中，两个靶位点突变和9个突变强烈影响t6A37形成，表明t6A37的缺失是线粒体病症的主要原因。 研究人员制备了带有G4296A突变的mt-tRNA的体外转录物并检查了其形成t6A37的能力。G4296A突变显着促进了t6A37的形成（图d），表明WT mt-tRNA中的G38残基在预防t6A37形成中起调节作用。 6.t6A37在患者细胞mt-tRNA中的低效。 为了验证患者细胞中突变mt-tRNA中t6A37的丢失，研究人员从患有MERRF，乳酸酸中毒，身材矮小和听力丧失症状的12岁女性患者获得了携带A15923G突变的成纤维细胞和成肌细胞。作了对照，研究人员确认了从患者成纤维细胞和成肌细胞中分离出的ttA-A37在mt-tRNA和ct- tRNA中没有减少。总之，这些结果与研究人员的体外突变研究一致，并且证明mtDNA中的致病性点突变损害患者细胞中mt-tRNA的t6A37形成，表明缺乏t6A37有助于线粒体疾病的分子发病机理。 7.线粒体t6A37对细胞内CO2敏感。 研究人员接下来测量了mt-tRNA线粒体t6A37形成的动力学参数，并确定了每种底物的表观Km值（图a）。 mt-tRNA的Km值为亚微摩尔（0.42μM），表明OSGEPL1在t6A37形成过程中对tRNA底物具有足够的亲和力。由于碳酸氢盐是由YRDC32催化的TC-AMP形成的底物，因此研究人员也测量了该反应的动力学参数。该反应的Km值为13mM，表明线粒体TC-AMP形成也需要高浓度的碳酸氢盐。 研究人员在增加碳酸氢盐浓度（20-40mM）的情况下监测t6A37的形成，揭示了t6A37形成的速率响应于碳酸氢盐浓度而增加。 对于这些实验，研究人员通过向裸鼠皮下注射结肠直肠腺癌HT-29细胞来制备实体瘤异种移植物，然后分离出mt-tRNA以及ct-tRNA用于RNA-MS分析。如补充图14所示，研究人员检测到t6A37在从肿瘤中分离出来的mt-tRNA中的低度调节，而在从细胞培养物中分离出的相同tRNA中观察到高t6A37频率。这个发现意味着t6A37频率可以通过实体瘤中的缺氧条件来调节。 讨论 本研究表明YRDC和OSGEPL1是mt-tRNA中t6A37形成所必需的。 YRDC主要定位于细胞质中，为KEOPS复合物提供TC-AMP以在细胞质tRNA中合成t6A37。然而，YRDC含有弱N末端MTS，并且YRDC的一部分被运输至线粒体。t6A37的多效性功能已经在细菌和酵母中得到广泛研究，这项研究为t6A37在人类细胞中的生理学作用提供了第一个证据。mt-tRNA中的致病性点突变抑制t6A37形成，导致线粒体蛋白质合成中的解码活性和tRNA功能缺失。研究人员还鉴定了致病点突变，其损害了mt-tRNA中t6A37的形成并确认了mt-tRNAThr中低水平的t6A37与从具有MERRF样症状的患者分离的A15923G突变，表明缺乏t6A37具有病理学后果。   |
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