细胞侵袭必备技能——Transwell

井里的怪兽 2018-09-21

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导读

上周我们介绍了研究细胞迁移的体外方法——划痕实验，与此同时细胞侵袭也是与转移密不可分的。那么今天要讲的是最常用的细胞侵袭方法：Transwell小室侵袭实验。与细胞划痕实验相比，Transwell相对过程复杂，因此常常会出现各种问题，下面就一起看看Transwell侵袭实验中需要注意的细节吧！

首先，为了对肿瘤侵袭和转移有更加清晰的理解，我们先来了解一下，肿瘤细胞转移的过程（如图1），主要包括以下5个过程：

原位侵袭（Local invasion），肿瘤细胞内渗（Intravasation），循环系统存活（Survival in the circulation），肿瘤细胞外渗（Extravasation），形成转移灶（Micrometastasis formation）等[1]。

肿瘤细胞转移过程[1]

其中细胞侵袭便发生在第一步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进入血管、淋巴管的过程，后期才开始进行转移。本期我们就为大家讲述利用transwell小室模拟细胞侵袭的实验方法。

Transwell 实验原理

Trans可译为转移，穿过，而well则为小室的意思。外形如同一个小杯子，杯底有通透性的膜（孔径0.1－12.0µm，细胞侵袭一般用8.0、12.0μm）。

实验原理：将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以膜相隔，并在膜上室铺基质胶，用来模拟体内细胞外基质。如果上室的细胞要转移到下室，需先分泌基质金属蛋白酶（MMPs ）将基质胶降解，才能通过膜，最后通过计数下室的细胞量即可反映细胞的侵袭能力。如下图右所示：

Transwell装置图（左为外形，右为内部构造）

侵袭过程：如下图为利用血清为诱导因子，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有血清培养基。这样细胞放无血清的培养基里，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。此时膜上涂一层基质胶，就可模仿细胞外基质，细胞必须要把基质消化了才可跑到下室，最后计算下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。

横纹肌肉瘤细胞侵袭图[2]

具体实验步骤

一、实验材料（提前1天准备）

Transwell小室
基质胶 常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。
上层培养液 上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，可以加入0.05%-0.2%BSA；
下层培养液 下层培养液采用含5%－10%FBS的培养基，具体浓度根据细胞转移力而定，转移力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子“引诱”细胞转移，如将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子；
细胞培养板 常用6孔板、12孔板、24孔板等。其中，以24孔板最常用，下面就以24孔板为例。

二、实验步骤

1. 铺基质胶：在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基或PBS缓冲液按照1：8比例稀释（其稀释比例需要摸索，选择一个细胞穿过适中的浓度即可），取100μl均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置0.5-1h，使其聚合成凝胶；

Tips:

将枪头沿小室内壁将Matrigel轻轻打出，切忌戳到小室滤膜；
加入的Matrigel胶的体积不可太大，把聚碳酸酯膜浸湿即可；
注意低温，枪头、小室等都应该4℃预冷。

2. 细胞培养：取对数生长期的待测细胞，并用PBS洗涤，接着用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度为1-10*10⁵/ml；

3. 接种细胞：在24孔板下室一般加入500-650 μL 含 5%-10%FBS 或趋化因子的培养基，然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液100－200μL 加入上室，最后放入培养箱中培养12-48h（根据癌细胞的转移能力而定）。

Tips:

尽量避免气泡的产生：下层培养液和小室间常会有气泡产生，会影响下层培养液的趋化作用。因此一旦出现大气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板；
注意细胞一定要接种均匀，建议沿着壁缓慢加入；
时间点的选择除了要考虑到细胞的转移能力以外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视，如某些药物会抑制细胞的增殖。

4. 细胞固定：取出小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600μL，将小室放入后固定20-30min。

5. 细胞染色及计数：弃固定液，用0.1-%0.2%结晶紫染色5-10min，PBS洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。适当风干后，在高倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。

三、举例：如在肿瘤相关的研究中，利用transwell小室检测肿瘤细胞的迁移及侵袭能力是十分常见的功能学实验。如下图：过表达miR-497能够抑制人骨肉瘤细胞MG-63的迁移和侵袭。

人骨肉瘤细胞MG-63的迁移和侵袭图[3]

四、数据处理：一般检测方法有2种：

1. 直接法：在显微镜下计数，选择不同的视野拍照（一般选择呈现视野中穿过的细胞），计数的结果可做成统计图，辅助呈现数据，如下图：

骨肉瘤细胞U2OS迁移及侵袭图[4]

2. 间接法：选择酶标仪测OD值做成统计图。在上述染色后，用3%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，取洗脱液在酶标仪上测量OD值（570nm），间接反映细胞数目，如下图：

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移图[5]

以上2个方法如何选择？

一般来说我们会选择计数法，但是若是针对细胞数量很多，难以计数清楚时，可以选择第二种方法。

常见问题解答

Transwell侵袭实验成功最重要的几个点？

根据实战经验，个人觉得主要在于：首先明确细胞是否具备侵袭能力；其次是实验过程必须细心，一气呵成，如上下室培养液的区别，切不可加错。

细胞不侵袭？

主要考虑3方面因素。首先，要确定该细胞是否具有侵袭的能力。建议实验前用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。另一方面，很可能是上室混有高浓度血清或者是小室孔径不对。此外，为了让实验结果更明显，可在无血清的情况下，让细胞饥饿12-24h，再进行实验。

细胞转移过多或过少？

如果细胞量过多且其转移能力强，容易造成计数困难；如果细胞量过少，可能还没有到检测的时间点，所有细胞都已穿过，容易造成假阳性结果。一方面图片不美观，更重要的是影响数据的准确性。所以把握接种密度很重要，需设置浓度梯度进行摸索。

拍照时局部图片对焦不清？

擦拭小室时避免太用力导致小室局部变形，进而导致拍照时局部对焦不清。此外，膜上本来就有小孔（白色透明的球形），所以切不可把小孔当做是细胞计数。

Transwell还可以用于什么实验？

Transwell还可用于细胞迁移实验，与侵袭区别仅在于不用再膜上室铺上基质胶；另外还可以用于细胞共培养（研究细胞分泌或代谢物对另一细胞的影响）；趋化性实验（研究某细胞分泌产物或某一因子/蛋白对另一细胞迁移的影响）。

参考文献

1.Valastyan S, Weinberg R A. Tumor Metastasis: Molecular Insights and Evolving Paradigms[J]. Cell, 2011, 147(2): 275-292.

2.Oue, T., Uehara, S., Yamanaka, H., Nomura, M. & Usui, N. Hedgehog signal inhibitors suppress the invasion of human rhabdomyosarcoma cells. Pediatric surgery international 29, 1153-1158 (2013).

3.Ruan, W.D., Wang, P., Feng, S., Xue, Y. & Zhang, B. MicroRNA-497 inhibits cell proliferation, migration, and invasion by targeting AMOT in human osteosarcoma cells. OncoTargets and therapy 9, 303-313 (2016).

4.Pan, Y., Wu, Q., Qin, L., Cai, J. & Du, B. Gold nanoparticles inhibit VEGF165-induced migration and tube formation of endothelial cells via the Akt pathway. BioMed research international 2014, 418624 (2014).

5.Long, X.H., et al. Tumor suppressive microRNA-424 inhibits osteosarcoma cell migration and invasion via targeting fatty acid synthase. Experimental and therapeutic medicine 5, 1048-1052 (2013).

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