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Ｓ11.2 细胞核的分离和细胞脱核技术

一、细胞核的分离
细胞核作为一个功能单位，完整地保存遗传物质，并指导RNA合成，进而表达出相应的蛋白，在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化(以肝细胞核分离为例)。
１.  配液
(1)溶液A：0.25mol/L蔗糖
10mmol/L Tris-HCL pH8.0
3mmol/L MgCL2
0.1mmol/L苯甲基磺酰氟化物(PMSF为蛋白酶抑制剂，用乙醇现配)
(2)溶液B：含0.1%(v/v)Triton×-100的溶液A。
(3)溶液C： 2.2mol/L蔗糖
10mmol/L Tris-HCL pH8.0
3mmol/L MgCL2
0.1mmol/L PMSF
２.操作步骤 全部操作须在冰浴中进行，所用溶液须预冷。
(1)大鼠在实验前禁食24h，断头处死，剖腹切取30g肝细胞用0.9%NaCL充分洗去血污，剪碎肝组织，然后按溶液A8mL/g肝脏组织加溶液A。
(2)取适量肝细胞悬液，移入带聚四氟乙稀头的玻璃匀浆器中，手工匀浆片刻。
(3)将匀浆液分成6管，以2000g离心10分钟。
(4)弃上清液，把粗提的细胞核悬浮于240mL溶液中，并通过4层纱布滤除粗渣。
(5)溶液分6管，以2000g离心10分钟，弃上清。
(6)沉淀物悬浮于240ml溶液B中，以2000g离心10分钟。
(7)弃上清，沉淀物悬浮于190ml溶液C中，取6支超速离心管，每管加5mL溶液C，然后把细胞核悬液铺在溶液C上层，以25000r/min离心60分钟。
(8)弃去上清，用溶液A轻轻荡洗管壁及沉淀物表面两次，将离心管倒置，用滤纸擦干管口。
(9)向离心管底部滴加几滴溶液A，用玻璃棒轻轻搅匀，然后补加30mL溶液A。
(10)以2000g离心20分钟，弃上清液，沉淀物为纯化的肝细胞核。