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WesternBlot（WB）,也称为免疫印迹，是用于鉴定蛋白质的最常用的实验室技术之一。 WB 作为一种强大且不可或缺的实验技术，虽然绝大部分人都会做，但如何提高 WB 准确性？如何增加对 WB 结果的信心？有诸多策略涉及其中。 例如适当的样品制备、验证一抗的质量、防止信号饱和并准确定量目标蛋白的信号强度等等。今天就给大家分享如何做好 WB 的完美攻略。 样品制备 制备是WB中经常被忽视的不准确因素来源。组织和细胞应该用液氮快速冷冻并尽快裂解，加快提取速度以避免内源性蛋白酶降解蛋白质。 常用的蛋白酶抑制剂： 值得注意的是对于斑马鱼等冷血动物，在低温提取其细胞内蛋白质时其细胞内活性反而较高，蛋白质容易降解，而在高温（50-60℃左右），其蛋白酶活性低，蛋白质降解少。 此外还应避免蛋白样品反复冻融，会对蛋白质的质量产生不利影响。 好的蛋白样品应该无蛋白降解，无交叉污染，蛋白质浓度不能过低，样品量不能太少。临床组织标本不可避免会存在血液粘附，应该避免切取带有大量血液的组织，否则会影响蛋白质定量的准确性。 无法避免时可使用预冷的 1xPBS 清洗组织后进行匀浆。临床标本一般比较珍贵，切取少量组织匀浆后余下组织应立即存于超低温保存备用。 通常将样品离心以除去「细胞碎片」或分离以富集感兴趣的样品。然而在某些情况下，去除「细胞碎片」或分离可能导致感兴趣的蛋白质显著损失，导致不正确的结果。当匀浆液在高浓度 SDS-PAGE 胶上电泳时「细胞碎片」会影响蛋白质印迹，但这些匀浆液在更低浓度的胶下电泳时可导致更准确的 WB 结果。 蛋白上样量和电泳 WB 上样量在不同实验室之间存在显著差别，大多数实验室一般上样总蛋白均在 20-40 μg 之间。 然而，一些实验室也会使用超过 100 μg 的总蛋白来检测较低丰度的蛋白质。在某些条件下，上样量过大可降低与 NC 膜和 PVDF 膜结合的低丰度蛋白的相对量。 上样量与上样体积相关，上样体积与玻璃板类型相关，不同类型玻璃板厚度与最大上样量的关系如下： 不同分子量的蛋白使用不同浓度的分离胶和对应的蛋白 Marker（常规Marker，大分子量及小分子 Marker）： 上样前将蛋白质变性的目的是打开蛋白质三维结构使抗体能够接近抗原表位。一般使用含阴离子变性去垢剂 SDS 的上样缓冲液，95-100℃ 煮沸 5-10 min。对于核蛋白提取时除增加裂解液体积和超声破碎次数外煮沸时间延长至 10-15 min。 关于内参抗体的选择，内参抗体有很多，包括 β-actin、GAPDH、LaminB、β-tubulin 等。选择内参抗体的原则是保证目的蛋白与内测蛋白分子量至少相差 5KDa 以上。假设目的蛋白分子量为 45KDa 则不适合使用 β-actin 作为内参，可以考虑 GAPDH 作为内参。 不同内参抗体定位及其分子量：
由于各个孔上样蛋白浓度不同导致上样体积也有差异。 如果上样体积差异过大会导致条带宽窄不一不美观，需使用上样 Buffer 将上样体积补齐至等体积，这样条带宽度一致，结果会更加美观。 最后需要注意，每次操作细节尽可能一致。比如使用相同的电泳仪，每次上样使用同样的进样针或枪，这有利于系统稳定，而且一旦出问题易于查找原因。 转膜 WB 中常用的固相材料有 NC 膜、PVDF 膜、DBM 膜等。PVDF 膜有两种规格，0.45μm 的膜适用于检测大于 20KDa 的蛋白质，0.2μm 膜适用于小于 20 的蛋白质。PVDF 需要在甲醇中浸泡 1-2min 激活。 不同分子量蛋白转膜条件有差别：
对于大分子量的蛋白质（>150KDa）建议湿转过夜，条件为恒压 20V 4 度过夜。 对于转膜结果的判读，转膜良好时丽春红染色可在膜上看见清晰、连续的粉红色条带，无白色圈圈出现。转膜不佳时，条带色淡，甚至无条带。转膜液可回收使用 1-3 次，反复使用可补充少量甲醇，避免浪费。 抗体质量，抗体稀释液和抗体孵育时间 为了成功进行蛋白质免疫印迹，一抗的质量是一个关键因素，因此，验证抗体对避免不准确的结果至关重要。 验证抗体包括确定目标蛋白质的最佳抗体浓度。值得注意的是多个条带的出现并不一定意味着抗体识别非特异性条带，因为一些蛋白质可能经过翻译后修饰或交替剪接，导致形式在不同分子量下运行但含有抗体识别的相同表位。 然而，许多商业抗体显示出与靶蛋白之外的抗原的非特异性结合。 如果非特异性相互作用发生在与靶蛋白充分不同的分子量上，则可以将一些识别非特异性蛋白质的抗体用于蛋白质印迹，以准确定量靶蛋白质。 有时我们可通过降低一抗浓度或通过改变抗体孵育时间来减少非特异性作用。5% 的脱脂牛奶封闭液是常用的封闭剂，封闭剂的低效率和封闭时间不足也会导致非特异性的条带增加。 但需注意，因为过度封闭也会导致靶蛋白的信号强度变差。研究者发现有些抗体在室温下孵育 2-4 小时会产生比在 4℃ 温育过夜时更强的信号。抗体稀释缓冲液中使用的吐温 20 的量对于减少背景染色也很重要。 如何确定抗体的特异性？使用阳性和阴性可以容易地确定抗体的特异性。最好的阳性对照是过表达目标蛋白的纯化蛋白质或裂解物，而最好的阴性对照是来自敲除动物组织的组织或细胞裂解物。 一些公司会出售与特异性抗体结合的肽可以很好的验证抗体。如果无法获得过表达目标蛋白的纯化蛋白或裂解物，许多公司如 Aviva Systems Biology，Cell Signaling Technology 和 Santa Cruz Biotechnology 都可以获得许多组织和细胞的裂解物，可用作阳性对照（已知靶蛋白在这些组织或细胞中高度表达）。 最近的一份出版物证明了验证抗体的必要性，该出版物显示了用常规使用的 tau 抗体进行蛋白质印迹时存在风险。该文献强烈建议在所有 tau 检测实验中使用阴性和阳性对照。我们建议在每种抗体进行至少一次蛋白质印迹中使用阴性和阳性对照。 检测抗体时单以分子量来判断抗体是否对靶标蛋白特异性是不令人满意的，因为许多蛋白质在 SDS-PAGE 上异常迁移。靶蛋白本身可以迁移至与预期不同的分子量，或者非特异性抗体相互作用蛋白可以与靶蛋白相同的预期分子量迁移。相对于不同类型的 SDS-PAGE 凝胶上的其他蛋白质，相同的蛋白质也可以不同的迁移。 WB 疑难解析
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