没错了,是支气管肺泡灌洗液(BALF)临床应用最有用的笔记! 作者|云南省一院孙丹雄 来源|医学界呼吸频道
前言 支气管肺泡灌洗(broncho alveolar lavage,BAL)是指通过支气管镜向支气管肺泡内注人生理盐水并进行抽吸,收集肺泡表面液体(诊断性)及清除充填于肺泡内的物质(治疗性),进行炎症与免疫细胞及可溶性物质的检查,达到明确珍断和治疗目的的技术。 20世纪60年代后期,可弯曲支气管镜首次应用于临床。1974年Reynolds和Newball报道用支气管镜进行BAL,为诊断呼吸系统疾病提供了一种新的检查手段。随着技术水平的提高,进一步发现从支气管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中可以获取细胞学、可溶性蛋白、酶类、细胞因子、生物活性介质等多种信息,因此BAL成为诊断某些肺部疾病如肺癌、间质性肺疾病、肺部感染性疾病的重要手段。 我国于2002年首次制定了《支气管肺泡灌洗液细胞学检查技术规范(草案)》(以下简称规范2002)。2012年,美国胸科医师学会颁布了《支气管肺泡灌洗液的细胞学分析在间质性肺疾病中的临床应用》(以下简称美国指南)。 目前国内外应用BALF检测病原体的具体操作及处理流程不同,为了进一步规范BAL的操作流程及标本处理,以便更好地指导临床,2017年,中华医学会呼吸病学分会感染学组组织专家撰写了《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识》,本文主要内容均参照该专家共识。 一
适应症:
禁忌症:
二 (1)术前准备 BAL操作前需要进行常规的临床状态评估,排除出血等风险,严格对照支气管镜检查的适应证及禁忌证。在支气管镜常规气道检查后,且在活检、刷检前进行BAL。局部麻醉剂为2%利多卡因。有条件开展静脉复合麻醉的医院,应尽量在静脉复合麻醉下进行,以获得支气管镜嵌顿较好、增加BALF回吸收量的效果,但需严格筛选患者,术前应评估有无静脉麻醉的禁忌证,年老体弱及心、肺、肝、肾等重要脏器功能不全的患者应慎用。术中应常规进行心电及脉搏血氧饱和度(SP02)监测。
(2)灌洗操作 1.部位选择:病变局限者选择病变段(特别是出现新的或进展性的浸润性病变的叶段);弥漫性病变者选择右肺中叶或左上叶舌段。 对于肺外周病变,有条件的单位可考虑采用径向超声支气管镜技术进行更准确的定位。 《美国指南》建议,对于未确诊的间质性肺疾病患者,在接受BAL操作前需要通过HRCT来决定BAL的具体部位,一般推荐在呈现磨玻璃影、大量结节或细网格影的部位进行操作。 2. 局部麻醉:在灌洗的肺段经活检孔注人2%利多卡因1ml~2ml,行灌洗肺段局部麻醉。静脉复合麻醉的患者如仍有强烈的气道反应,同样可注人2%利多卡因1ml~2ml。 麻醉要充分,咳嗽反射必须得到充分抑制,防止因剧烈咳嗽引起的支气管黏膜损伤出血,影响BALF的回吸收量和检测结果。 3.注人生理盐水:支气管镜顶端嵌顿在目标支气管段或亚段开口后(嵌顿要紧密,防止大气道分泌物混人或灌洗液外溢),经操作孔道快速注人37℃或室温灭菌生理盐水,总量为60ml~120ml,分次注人(每次20ml~50ml)。 4.负压吸引:注人生理盐水后,立即用合适的负压[一般推荐低于100mmHg(1mmHg=0.133kPa)]吸引获取BALF,总回收率>=30%为宜。 注意负压不宜过大,也可根据情况进行调整(-100ml ~ -150mmHg),以吸引时支气管腔不塌陷为宜。 5.BALF收集:用于病原学分析的标本需用无菌容器收集;细胞学分析需选择硅化的塑料容器或玻璃容器以减少细胞的黏附。如考虑为大气道疾病时,建议第1管回吸收液单独处理;非大气道疾病时,可将所有标本混合后分送。
备注 1.李强《呼吸内镜学》、《规范2002》均推荐灌洗量为每次25ml~50ml,总量100ml~250ml,一般不超过300ml;《美国指南》则建议,经支气管镜灌入室温生理盐水100ml~300 ml,均分为3次~5次序贯灌入。 灌洗量的多少可影响标本检测的结果,包括细胞比例、蛋白含量及GM水平等。具体灌洗多少生理盐水是合适的,不同文献甚至指南的推荐均有差异。Rennard等发现,灌入20ml液体后获得的回吸收标本内含有更多的上皮细胞和铁蛋白,表明该标本更可能是BALF。 研究结果表明,在灌入60或120ml液体时所回吸收标本的检测结果差异明显,至少灌入120ml生理盐水时所回吸收的标本结果才相对稳定。上述文献主要集中于健康成人及间质性肺疾病患者的观察,对于肺部感染性疾病患者,基于查找病原体的目的,又要防止在灌洗过程中感染的扩散,本共识认为采用60ml~120ml的灌洗剂量,且分次灌洗,是比较好的方法。 2.《美国指南》建议若每次的回收率均<5%,则要及时停止灌洗以免液体大量潴留于肺内。 3.李强《呼吸内镜学》建议,合格的BALF标准为:
4.《规范2002》建议,合格的BALF标准为:
5.其他注意事项:灌洗液一般可从支气管镜操作孔道直接注入,也可先置人导管再从导管注人进行远端肺泡灌洗,可减少灌洗液的反流,且灌洗量可适当增多;也可置人前端带气囊的导管,灌洗时将气囊充气并紧密嵌顿于段或亚段支气管开口,进行保护性支气管肺泡灌洗。 对于病原体相关检测,用无菌容器收集BALF标本,送检量一般需要10ml~20ml(≧5ml),贴好标本信息标签,应在室温2h内送至微生物实验室。若延迟送检,可将标本放置于2~8℃保存,并在报告中说明并提示可能对培养结果造成的影响。 BALF的储存对于GM的检测结果非常重要。获取BALF标本后,应尽快送至实验室完成检测。BALF的GM水平在4℃条件下24h内保持稳定。血清和BALF的GM水平在零下20℃条件下可以存放11个月保持相对稳定。如果标本在采集后立即送到实验室检测,可在室温下转送,要求送检时间<4h。如果送检时间超过4h,应在4℃下保存,可以储存24h;超过24h的标本,不适合再送检。 备注: 1.李强《呼吸内镜学》建议留置BALF的容器周围宜被冰水(-4℃)包围,30min内送至实验室,通常在2h~3h内处理。 2.《规范2002》建议留置BALF的容器应置于含有冰块的保温瓶中,立即送往实验室检查。 3.《美国指南》建议,BALF的转运条件因获取BALF后处理、分析标本的时间不同而不同。
4.王洪武等《支气管镜介入治疗.第二版》则建议,灌洗液应置于冰上保存(室温保存则不超过1h),尽快送至实验室。25℃时BALF的细胞成分可存活4h。
(4)BALF的预处理 对获取的BALF,特别是含有黏液成分时,是否需要无菌纱布过滤? 本共识认为不需要常规过滤,因为在过滤过程中,细胞会黏附于纱布,损失部分细胞及其他成分,如肺孢子菌更多的存在于黏液成分中。过滤过程会使标本的稳定性受到影响,且存在污染的可能性。
备注: 1.《美国指南》建议,可以用纱布把BALF中的大块黏液滤去,或必要时用二硫苏糖醇来化解残存的少量黏液。 2.李强《呼吸内镜学》建议,先用单层纱布过滤以去除黏液,将滤液离心后分离上清液供生化和免疫学检查,沉淀物供细胞学检查。 3.《规范2002》建议,回收液体应立即用双层无菌纱布过滤除去粘液,并记录总量。 (5) 并发症 目前认为BAL是一种相对安全的检查方法,在支气管镜操作技术熟练及准确评估患者适应证及禁忌证的情况下,较少发生严重的并发症,常见的术中和术后并发症有:
三 (1)显微镜检查
1.革兰染色及BALF质量评价:建议使用细胞离心机制片,取适量BALF标本600r/min~1000 r/min离心10min~20min,进行革兰染色。低倍镜下若鱗状上皮细胞占全部细胞(不包括红细胞)的比例>1%,提示标本被上呼吸道分泌物污染;柱状上皮细胞>5%时,提示BALF并非来自于远端气腔。 BALF标本质量不合格也可以检验,但应在报告单中注明。观察革兰染色结果及白细胞情况,如果见到噬菌现象,需报告吞噬细菌的中性粒细胞占全部中性粒细胞的比例,通常数值为5%时可作为肺炎诊断的阈值。
2.抗酸染色:用于检测分枝杆菌,弱抗酸染色可用于检测奴卡菌。
3.氢氧化钾(KOH)压片:用于真菌,特别是丝状真菌的形态学观察。
4.六胺银染色:常用于肺孢子菌的检测。
5.墨汁染色:用于隐球菌的检测。
6.免疫荧光显微镜:可用于军团菌、肺孢子菌及病毒的检测。
(2)培养
1.一般细菌培养(定量培养):
2.真菌培养:BALF标本(1500~1800)×g,离心10~20min,沉淀物混匀后 接种于沙保平板上,30℃和35℃孵育7d。 怀疑双相真菌时应使用带螺帽的培养基,孵育6周。
3.特殊病原菌培养:BALF离心后的沉淀物还可用于分枝杆菌、军团菌及病毒等的培养。
(3)核酸检测 涡旋震荡BALF标本30~60S,然后将BALF标本(1500~1800)×g,离心15~20min,沉淀物混匀后,用于病毒、军团菌、肺孢子菌或分枝杆菌等的检测。
(4)真菌抗原 涡旋震荡BALF标本30~60S,然后将BALF标本(1500~1800)×g,离心15~20min,取上清液查真菌抗原。GM试验主要用于曲霉的检测,目前有关检测BALF中隐球菌荚膜抗原的研究证据较少,可考虑作为诊断的补充手段。
(5)细胞总数和分类计数检测
《规范2002》的建议 ① 将BALF装入塑料离心管内,在4℃下以1200r/min离心10min,上清(原液或10倍浓缩)-70℃储存,用做可溶性成分的检测; ② 经离心沉淀的细胞成分用Hank's液(不含钙离子、镁离子),在同样条件下离心冲洗2次,每次5min。丢弃上清后加Hank's液3~5ml制成细胞悬液。也可用灌洗原液以减少细胞丢失; ③ 在改良的Neubauer计数台上计数BALF中的细胞总数,一般以1×109/L表示。如果细胞数过高,再用Hank's液稀释,调整细胞数为5×109/L,并同时将试管浸入碎冰块中备用; ④ 细胞分类计数:采用细胞离心涂片装置,加入备用细胞悬液(细胞浓度为5×109/L)100uL,在4℃下以1200r/min离心10min,通过离心作用将一定数量的BALF细胞直接平铺于载玻片上。取下载玻片立即用冷风吹干,置于无水乙醇中固定30min后进行染色,一般用Wright或HE染色; ⑤ 在40倍光学显微镜下计数200个细胞,进行细胞分类计数。 备注: 1.《美国指南》建议,通常使用血细胞计数器来获得有核细胞总数,使用台盼蓝不相容试验来鉴定细胞活性。细胞离心、染色[瑞氏姬姆萨(Giemsa)染色或迈格姬(MGG)染色]后进行分类计数检测,每次至少需要计数400个细胞。 2.王洪武等《支气管镜介入治疗.第二版》的操作步骤与上述相同,但在进行细胞计数时(步骤5),则建议:常采用细胞离心涂片8~10张,应用25倍和40倍光学显微镜进行分类。随机计数200~500个细胞,进行细胞分类计数。酯酶染色法可以区分未成熟的巨噬细胞和大淋巴细胞。红细胞以及纤毛或鳞状上皮也要进行计数,但不归入细胞分类计数中。如果BALF上皮细胞超过5%提示支气管灌洗成分污染,BAL样本不合格。
李强《呼吸内镜学》 里面介绍的一种试管离心的细胞涂片法,比较简便易行。 其体做法为将BALF用单层纱布滤除黏液后,以300r/min离心10min,使细胞与液体分离,去除上清液后所获得的细胞团充分震散,即刻作涂片、吹干。制得的细胞涂片,用Wright-Giemsa(或Wright或MGG)染色,在油镜下至少计数300个细胞作细胞分类。
(6)T淋巴细胞亚群的检测 《规范2002》的建议: ① 采用间接免疫荧光法,将上述获得的BALF细胞成分,用10%小牛血清RPMI1640培养液3~5ml制成细胞悬液。 ② 将细胞悬液倒入平皿中,置于37℃5%CO2培养箱中孵育2h,进行贴壁处理,去除肺泡巨噬细胞。 ③ 取出细胞悬液,再用Hank's液冲洗离心1次,弃上清留20μL~100μL。经贴壁处理后的细胞悬液中,肺泡巨噬细胞显著减少,淋巴细胞相对增多。 ④ 将经贴壁处理的细胞悬液分装3个小锥形离心管内,每管20μL~30μL,用微量加样器向标本中加单克隆抗体CD3、CD4和CD8各20μL~40μL,混匀置于4℃冰箱中作用1~2h。 ⑤ 取出标本,先用Hank's液冲洗离心2次,以12000r/min离心20S,然后加羊抗鼠荧光抗体各20μL~40μL,置于4℃冰箱中作用30min。 ⑥ 取出标本用Hank's液以同样速度和时间离心冲洗2次,弃上清留20μL充分混匀细胞,取1滴于载玻片上加盖玻片。荧光显微镜下数200个淋巴细胞并计算出标有荧光细胞的阳性率。
备注:王洪武等《支气管镜介入治疗.第二版》的操作步骤与上述相同。
(7)细胞学分析 王洪武等《支气管镜介入治疗.第二版》: BALF脱落细胞分析有助于诊断某些肿瘤和弥漫性肺疾病,临床上怀疑相关疾病时,应对涂片进行特殊染色。检查肿瘤细胞常用Papanicolaou染色;怀疑肺泡蛋白沉着症是则选择过碘酸-雪夫染色(PAS),检测脂蛋白物质;怀疑肺出血或铁尘肺时,普鲁士蓝染色用于检测含铁血黄素,发现慢性出血或弥漫性肺泡出血时,可见吞噬红细胞的巨噬细胞,如果超过200个巨噬细胞的20%染色为阳性,即可诊断弥漫性肺泡出血。
(8)可溶性成分 BALF中存在多种可溶性成分,主要来源于被动漏出(例如白蛋白)、主动转运(如免疫球蛋白)和局部产生分泌成分等。检测这些成分的方法很多,因标本稀释、灌洗方法等不同造成标本稀释差异,肺泡上皮通透性等诸多因素均可影响检测结果,导致研究结果差异较大。因此,可溶性成分的意义尚未运用于临床。 四 (1)肺部感染性疾病 ① 微生物学涂片检查:BALF中的沉淀物进行革兰染色、抗酸染色及真菌的特殊染色,对细菌、分枝杆菌、真菌及寄生虫的检出有较大意义。 ② 微生物学培养:在严格无菌操作下采集的BALF进行直接接种培养或取其沉淀物进行培养,对检测细菌及真菌具有较大的临床意义,菌落计数BALF ≥ 104 CFU/ml或防污染BALF ≥ 103 CFU/ml时认为是可能的病原菌,但不能机械使用该阈值,还要结合患者的实际情况及有无使用抗菌药物等因素综合判断。 ③ 灌洗液中GM测定:对于早期快速诊断侵袭性肺曲霉病,特别是气道曲霉感染的患者具有重要的临床价值。对于侵袭性肺曲霉病,BALF-GM已被列人IDSA和EORTC/MSG推荐的诊断标准之一。但在临床诊治工作中,不能仅凭BALF-GM的结果进行抗真菌治疗,需要结合临床资料及影像学表现等进行综合分析,来判断BALF-GM阳性结果的意义。 ④ 对于某些特殊病原体,如病毒、肺孢子菌及寄生虫等可通过BALF中的抗原或核酸测定进行诊断。 ⑤ 细胞学分类:灌洗液中以中性粒细胞比例增高为主时,见于各种细菌或真菌等感染;以淋巴细胞比例增高为主时,见于病毒性肺炎,但也可见于结节病或过敏性肺炎等;以嗜酸粒细胞比例增高为主时,见于变应性支气管肺曲霉病,但也可见于嗜酸粒细胞浸润症、支气管哮喘等。
(2)肺部恶性肿瘤 纤维支气管镜下BAL对肺癌诊断有重要的价值,有较高的阳性率。文献报道BAL诊断呼吸道原发性或继发性恶性肿瘤可获得较好的结果,包括肺周围型恶性肿瘤、弥漫性肺恶性肿瘤(如细支气管肺泡癌)、肺转移癌、癌性淋巴管病、淋巴瘤等。 BAL的结果,受肿瘤的病理类型和肿瘤大小的影响,腺癌和肺泡癌阳性率最高。一般地能确定肿瘤细胞类型的平均肿瘤大小为4.9±1.8cm,不能诊断的患者,肿瘤平均大小为2.6±1.2cm。 如果BAL对恶性肿瘤诊断率较低.其原因可能是:
(3)间质性肺疾病
一般情况下,不能单凭BALF的分析结果来确诊某一疾病,但结合临床资料,BALF的细胞学分析结果可以支持某些诊断,大大缩小间质性肺疾病(ILD)的鉴别诊断范围。但是,鉴于BALF细胞学分析结果的敏感度和特异度都不高,其广泛应用还有待进一步探讨。 疑诊ILD的患者接受BAL后,建议对其BALF进行细胞分类检查,包括淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和肥大细胞计数;剩下的标本还可以根据临床情况进行微生物学和(或)找瘤细胞等检测。
1. 外观 有时候BALF的外观有一定的提示意义:如BALF呈血性,且颜色逐渐变深则提示急性弥漫性肺泡出血;BALF外观呈云絮状(即牛奶或淘米水样),放置15min~20min后可见絮状物沉淀则高度提示为肺泡蛋白沉积症。
2. 参考值范围 健康非吸烟者的BALF细胞构成的参考值范围为:巨噬细胞>85%,淋巴细胞10%~15%,中性粒细胞≤3%,嗜酸粒细胞≤1%,鳞状上皮细胞或纤毛柱状上皮细胞均≤5%。
3. 细胞模式 在除外感染后,BALF中有核细胞数量的增高以及各种细胞类型的比例异常均可提示或支持某种ILD类型。混合细胞模式可见于任何的ILD,在观察到混合细胞模式时,占优势的细胞类型一般与特定的ILD诊断最为相关。 BALF细胞模式分为:
4.细胞分类临床意义
5.淋巴细胞亚群 淋巴细胞亚群分析(流式细胞分析或免疫组织化学方法)不需要作为常规检查,建议仅在临床怀疑是淋巴细胞相关性疾病或BALF细胞分类的初步结果提示为淋巴细胞增多型时进行。 BALF中的CD4 /CD8 比值会随年龄而变化,对ILD的诊断价值有限。如果临床及影像学表现均支持结节病的诊断,BALF中淋巴细胞增多同时伴CD4 /CD8 的比值显著升高(如CD4 /CD8 >4),则高度提示结节病的诊断。
参考文献: 1. 李强. 呼吸内镜学(精)[M]. 上海科技出版社, 2003. 2. 中华医学会呼吸病学分会.支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范(草案)[J].中华结核和呼吸杂志,2002,25(7):390-391. 3. 黄慧,邵池,徐作军.美国胸科协会官方指南——支气管肺泡灌洗液的细胞学分析在间质性肺疾病中的临床应用(摘译本)[J].中华结核和呼吸杂志,2012,35(9):650-654. 4. 中华医学会呼吸病学分会. 肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识(2017年版)[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2017, 40(8). 5. 王洪武, 金发光, 柯明耀. 支气管镜介入治疗(第二版)[M]. 人民卫生出版社, 2017. |
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