枯草芽孢杆菌PTS－394可湿性粉剂田间防治辣椒根腐病的高效使用方法与流程

​本发明属于生防菌剂应用技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂田间防治辣椒根腐病的高效使用方法。

背景技术：

设施辣椒是江苏省现代农业中农民增收的主要产业，每年种植面积达100-120万亩次。然而，由于设施的密闭环境和不断的重茬连作，造成土壤病原菌累积，土传病害(猝倒病、枯萎病、根腐病、立枯病、疫病、青枯病等)频繁爆发。近年来，由茄柄镰刀菌引起的辣椒根腐病逐步成为设施栽培的重要病害，平均发病率达10-30％，减产20％-50％，已经严重制约了设施辣椒的安全生产和品质保证。

目前，生产上防治设施辣椒根腐病主要依靠化学农药，但防治效果一直不理想，根腐病仍然发生较为严重；此外，化学农药易造成设施生态环境污染，增加蔬菜农产品农药残留，给人类健康带来严重危害。近年来虽有研究生防微生物来控制辣椒根腐病的相关报道，但主要集中于辣椒根腐病生防菌的筛选，尚未有成型的生防制剂产品示范推广并进入市场。目前，国外已有Becker Underwood公司开发的SubtilexNG(活性成分为枯草芽孢杆菌MBI 600)产品，可在根部施用或拌种防治镰刀菌(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)和丝核菌属(Rhizoctonia spp.)引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害。国内已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、依天得、根腐消等。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”(10亿/g枯草芽孢杆菌B908可湿性粉剂)获得农业部登记注册，已在多个省推广使用，推广面积约4 667hm2，主要防治水稻纹枯病、三七根腐病、烟草黑胫病。江苏省农科院植保所陈志谊研究员开发的“纹曲宁”是100亿活芽孢/ml枯草芽孢杆菌Bs916水剂和2.5％井冈霉素的复混制剂，主要防治水稻纹枯病和稻曲病，现已在江苏等地得到广泛推广。根腐消为昆明沃霖生物工程公司登记注册的由枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌复配的可湿性粉剂，通过灌根处理防治三七根腐病。

江苏省农业科学院植物保护研究所2006年以来开展设施蔬菜重要土传病害病原菌的种类、生物学特性和发病规律的研究，以几种重要土传病害(茄果类蔬菜青枯病、枯萎病、立枯病、根腐病)病原菌为靶标，筛选获得了一株高效拮抗菌株，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PTS-394，中国微生物保藏中心菌株保藏号为：CGMCCNo.8085(申请号为201110339098.X的中国专利)。随后，通过优化其发酵工艺(申请号为201310081080.3的中国专利)，并成功研制枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂。随着大部分的蔬菜种植户对生物防治的理念的接受，相应的生物农药高效使用技术已成为防治中的关键所在，为了解决在田间应用时，农户往往各自凭经验使用生物农药(PTS-394可湿性粉剂)、用药时期、用药方式和用药剂量混乱，从而造成各地田间土传病害防治效果不稳定(40-85％)的情况，我们前期已经针对设施茄果类蔬菜青枯病、枯萎病、辣椒立枯病和草莓根腐病田间用药技术进行了研究筛选(申请号为201510760770.0的中国专利申请)。

本发明主要涉及枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂在防治辣椒根腐病、促进辣椒生长等的高效使用方法，是上述PTS-394已有研究发明的进一步丰富和扩充。本发明主要通过在实验室内，温室盆栽和田间小区等筛选了枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂在防治辣椒根腐病、促进辣椒生长中的使用时间、剂量和方式等，并进一步集成，形成详细的高效使用技术，为枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂的田间高效使用和示范推广提供理论保障。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有生防微生物农药因田间使用技术不足造成的防效不稳定现象，而提供了一种枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂田间防治辣椒根腐病的高效使用方法。该方法不仅进一步拓展了枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂的使用范围及防治目标，也为枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂的进一步市场化和田间使用提供了理论基础。

本发明采用如下技术方案：

枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂田间防治辣椒根腐病的高效使用方法，包括以下步骤：

步骤一，种子处理：选取饱满种子，在水中浸泡，随后将种子在PTS-394WP的稀释液中浸种过夜；

步骤二，育苗基质拌施：落种前，穴盘育苗的营养土用PTS-394WP拌土处理，均匀拌土并进行点播；

步骤三，定植处理：移栽前，用PTS-394WP撒施定殖穴，移栽后浇活颗水；

步骤四，移栽后5-7d浇缓苗水，移栽15-20d后用PTS-394WP的稀释液灌根，并进行根部培土：

步骤五，依据不同种植茬口根腐病发生的时间，同步水肥规律，每间隔15-20d使用一次PTS-394WP的稀释液进行灌根，直至根腐病重要发生期结束；

步骤六，在果实膨大期，用PTS-394WP的稀释液灌根；

步骤七，其他病虫害按常规模式管理。

更进一步地，步骤一具体为：选取饱满种子，在温水中浸泡4-5h，随后将种子在PTS-394WP的稀释液中浸种过夜，步骤一中述PTS-394WP为PTS-394可湿性粉剂。

更进一步地，步骤一中所述温水的温度为40-55℃，所述PTS-394WP的稀释液为PTS-394WP与水按照1∶1000的质量比混合后得到的稀释液，所述浸种过夜的时间为12-16h。

更进一步地，步骤二中所述拌土时，PTS-394WP与营养土的比例为10kg菌粉/m3营养土。

更进一步地，步骤三中移栽前，按照8g PTS-394WP/棵苗均匀撒施定殖穴，且浇水时每棵苗浇水800mL。

更进一步地，步骤四中所述PTS-394WP的稀释液为PTS-394WP与水按照1∶100的质量比混合后得到的稀释液，且灌根时按照400ml稀释液/棵苗进行灌根。

更进一步地，步骤五中所述PTS-394WP的稀释液为PTS-394WP与水按照1∶100的质量比混合后得到的稀释液，且灌根时按照400ml稀释液/棵苗进行灌根。

更进一步地，步骤五中所述依据不同种植茬口根腐病发生的时间，同步水肥规律，具体为：春茬：在辣椒定植(3月中旬)后，追施2次；秋冬茬：在辣椒定植(9月中旬)后追施2次；越冬茬：在辣椒定植(11月中旬)后追施1次，来年4月份开始再次追施2次。

更进一步地，步骤六中所述PTS-394WP的稀释液为PTS-394WP与水按照1∶1000的质量比混合后得到的稀释液。

本发明与现有技术相比，其有益效果主要通过以下途径实现，具体如下：

本发明首先通过平板对峙实验，初步明确了PTS-394菌株可湿性粉剂甲醇提取物对辣椒根腐病菌(茄柄镰刀菌)具有较好的抑制作用；

进一步的质谱检测，发现可湿性粉剂中仍然含有脂肽类物质，但是脂肽类物质的种类及含量都有较多的损失。这表明从拮抗菌株的筛选到开发为成熟的制剂产品，会对生防菌本身的特性有较大改变；温室辣椒盆栽的促生、防效等的评估实验显示，枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂的使用浓度对辣椒的促生、防效有影响，具体呈现为：低剂量具有促生作用，而较高浓度具有防治作用。以上研究结果，为枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂在田间的应用，提供了合适的使用浓度和使用时间等的筛选，随后的田间小区试验进一步完善了枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂田间防治辣椒根腐病的高效使用方法，该方法为枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂在田间的使用提供了更具体更详细的操作过程，不仅拓展了枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂的使用范围及防治目标，还为枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂的进一步市场化和田间高效使用提供了理论基础。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌PTS-394对辣椒根腐病菌的抑制作用示意图，其中PTS-394为PTS-394菌体；PTS-394YM为YPG发酵液甲醇提取物；PTS-394WPM为PTS-394可湿性粉剂甲醇提取物；PTS-394WPM10为PTS-394可湿性粉剂甲醇提取物稀释10倍；Control为甲醇。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂田间防治辣椒根腐病的高效使用方法，包括以下步骤：

步骤一，种子处理：选取饱满种子，在温水(40-55℃)中浸泡4-5h，随后将种子在PTS-394WP稀释液(1∶1000)中浸种过夜(12-16h)；

步骤二，育苗基质拌施：落种前，穴盘育苗的营养土用PTS-394WP拌土处理，按照10kg菌粉/m3土壤(1kg菌粉∶100L土壤)比例，均匀拌土并进行点播(兼具防苗期病害和促进种子萌发作用)；

步骤三，定植处理：移栽前，枯PTS-394WP按照8g/棵苗撒施定殖穴，移栽后浇活颗水，每棵苗浇水800mL，相当于将菌粉稀释100倍，用于防治根腐病；

步骤四：移栽后7d浇缓苗水，移栽15-20d后按菌粉1∶100倍稀释液灌根(400ml/棵苗)，并进行根部培土；

步骤五：依据不同种植茬口根腐病发生的时间，同步水肥规律，每间隔15-20d使用一次PTS-394WP(按菌粉1∶100倍稀释液灌根400ml/棵苗)，直至根腐病重要发生期结束(春茬：在辣椒定植(3月中旬)后，追施2次；秋冬茬：在辣椒定植(9月中旬)后追施2次；越冬茬：在辣椒定植(11月中旬)后追施1次，来年4月份开始再次追施2次)；

步骤六：在果实膨大期，可使用PTS-394WP(1∶1000)灌根，用于促进植株和果实生长；

步骤七：其他病虫害按常规模式管理。

实施例1：枯草芽孢杆菌PTS-394及其可湿性粉剂对辣椒根腐病原菌的抑制作用

试验用生防枯草芽孢杆菌PTS-394、辣椒根腐病致病菌——茄柄镰刀菌HALJ3-1均由江苏省农业科学院植物保护研究所水稻病害与生物防治研究室分离、保存。生防枯草芽孢杆菌PTS-394粉剂由扬州绿源生物化工有限公司加工(2016年加工，含量约为2×1010 CFU芽孢/g菌粉)。辣椒根腐病菌在PDA培养基中活化培养。枯草芽孢杆菌PTS-394在改良YPG(yeast peptone glucose)培养基(酵母膏5g、胰蛋白胨5g、葡萄糖5g、pH 7.0～7.2，固体培养基需加琼脂15g)中活化培养。

抑菌试验采用平板对峙法：

1)将PTS-394在YPG固体培养基上活化，然后单胞移入5mL YPG培养液中，在28℃下振荡(150r/m)培养12h，按照1％接种量，接种PTS-394菌液入YPG液体中在28℃下振荡(150r/m)培养48h，获得发酵液，同时利用盐酸沉淀YPG发酵液，甲醇提取纯化脂肽类化合物，最终按照1∶10比例进行甲醇溶解，4℃保存备用，此甲醇提取液标记为PTS-394YM。将5g枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂溶解于5mL色谱甲醇(pH＝7.0)，4℃过夜浸提粉剂中的脂肽类化合物(约16h)，0.22μm过滤，4℃保存备用，并此甲醇提取液标记为PTS-394WPM。

2)抑制菌丝生长实验：辣椒根腐病菌HALJ3-1在PDA平板28℃活化培养，3d后沿菌落边缘用打孔器(直径5mm)打孔，将菌饼置于空白PDA平板中央，在距离菌饼25mm处，呈“十字”型，滴入PTS-394菌液1μL或者甲醇脂肽类物质提取物50μl(吹干)，每处理重复3次，设置对照。所有平板在28℃恒温培养，待对照平板长满时调查抑菌带宽。

3)脂肽类物质抑制孢子萌发实验：辣椒根腐病菌HALJ3-1在PDA平板28℃活化培养，3d后沿菌落边缘用打孔器(直径5mm)打孔，将菌饼置于无菌水中震荡获得孢子液(调整浓度至104个孢子/mL)。在空白PDA中涂布根腐菌孢子液100μL，以平板中心呈“十字”型打孔，加入甲醇脂肽类物质提取物50μl(吹干)，每处理重复3次，设置对照。所有平板在28℃恒温培养，待对照平板长满时调查抑菌带宽。实验结果如图1所示：

采用体外平板对峙法分别检测了枯草芽孢杆菌PTS-394菌体，PTS-394在YPG的发酵液脂肽类提取物和PTS-394可湿性粉剂脂肽类提取物对辣椒根腐病菌(茄柄镰刀菌)孢子萌发和菌丝生长的抑制实验，图1表明，枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂脂肽类提取物对根腐病菌的孢子萌发和菌丝生长都具有和PTS-394培养基发酵液一样的抑制作用。抑菌测量数据显示，PTS-394可湿性粉剂对菌丝的抑菌带宽5mm，对孢子的萌发抑菌圈直径为13.33mm，而PTS-394发酵液脂肽类物质对菌丝的抑菌带宽为8.67mm，对孢子的萌发抑菌圈直径为20.67mm，以上结果表明，PTS-394可湿性粉剂中仍旧含有脂肽类物质，但其抑菌作用比PTS-394发酵液的效果都显著降低，这可能是可湿性粉剂在加工过程中损失造成的。

实施例2：枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂的脂肽类抗生素检测

枯草芽孢杆菌PTS-394在YPG培养基中的发酵及其脂肽类物质提取方法按照实施例1中描述进行；枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂中的脂肽类物质的提取按照实施例1中的方法，即利用甲醇(pH＝7.0)浸提，浸提液-20℃长期保存。利用基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测PTS-394粉剂甲醇浸提液和PTS-394发酵液中含有脂肽类物质的种类，基质为α-氰-4-羟肉桂酸(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid)。检测结果如表1所示：

表1 枯草芽孢杆菌PTS-394发酵液和可湿性粉剂甲醇提取液含脂肽类物质的质谱检测

(注，“-”表示未检测到)

利用离子飞行质谱(MALDI-TOF-MS)对PTS-394YPG培养基发酵液甲醇提取物和PTS-394可湿性粉剂甲醇提取物进行扫描检测，波长在200-1600nm之间。经过比对分析，可以确定PTS-394的YPG发酵培养液和可湿性粉剂的甲醇提取物中都能够检测到Surfactin和Fengcyin两类脂肽类物质(表1)。从表1中看出，PTS-394可湿性粉剂中可以检测到分子量为1021.6，1035.7和1049.6的Surfactin与分子量为1490.8的Fengycin，而PTS-394发酵液中还包含有993.6和1007.6的Surfactin与分子量为1476.8和1504.8的Fengycin；此外，我们还发现，PTS-394粉剂中含有脂肽类物质的质谱检测强度(intensity)仅为PTS-394发酵液的2‰-1％，这一结果表明，在PTS-394粉剂加工过程中Surfactin和Fengycin都有大量损失，这也是其抑制作用下降的主要原因。

实施例3：枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂对辣椒的促生作用

1.辣椒种子萌发实验：1)将PTS-394粉剂按照1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、和1∶1000倍稀释备用。辣椒种子于3％次氯酸钠溶液中浸泡5min灭菌，无菌水冲洗至无味，随后将辣椒种子放置在不同稀释倍数的PTS-394菌液中浸泡24h，对照用无菌水浸种；将种子取出，沥干菌液后放置于含有4层无菌滤纸的培养皿中，随后覆盖灭菌纱布2-3层，并加无菌水10mL，每平板播种30粒，重复3次，6d后统计种子发芽情况，计算萌发率。2)将PTS-394粉剂与穴盘播种营养土按照1∶100，1∶200和1∶1000倍体积比拌土，制作72孔穴盘苗床，将辣椒种子干播入穴盘中，每孔1粒，播种后盖土浇水，置于温室中(自然光照，15℃-28℃)，对照为正常营养土播种；重复3次，15d后检查出苗情况，计算萌发率。

2.常规土壤按照过筛自然土，营养土和蛭石1∶1∶1∶1配比准备用于温室促生实验。先将辣椒种子播入常规土壤，待辣椒苗4叶1心时，依据促生相关处理要求移栽辣椒苗于单独盆钵中，置于日光温室生长(自然光照，15℃-28℃)。1)温室盆栽植株促生试验：设4个处理，分别是常规对照(CK)、灌根PTS-394粉剂1∶100倍液处理(PTS-1∶100)，灌根PTS-394粉剂1∶200倍液处理(PTS-1∶200)和灌根PTS-394粉剂1∶1000倍液处理(PTS-1∶1000)。每处理30钵，重复3次。3个PTS-394实验处理中，每棵辣椒灌根PTS-394粉剂稀释液20mL。移栽后第25d时，测定植株株高，并进行统计分析枯草芽孢杆菌PTS-394粉剂的促生效果。具体实验结果如表2所示：

表2 枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂对辣椒的促生作用

平板萌发率、穴盘萌发率和株高分别为处里后6、15、25d的数据。表中数据为平均数±标准差。No，表示未进行相关处里实验。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验差异显著(P＜0.05)。

表2中是枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂对辣椒种子萌发和植株生长的促进作用。平板催芽实验显示，不同浓度的PTS-394菌剂稀释液对辣椒种子萌发影响不同，催芽6d后，无菌水对照的萌发率为41.1％，而PTS-394菌剂1∶1000，1∶200和1∶100倍的稀释液处理的种子萌发率分别为66.7％，58.3％和60％，比对照显著促进了种子的萌发；此外，PTS-394菌剂1∶10倍处理的种子萌发率仅为24.4％，显著抑制了辣椒种子的萌发。温室穴盘(土壤)育苗结果显示，PTS-394菌剂按1∶100，1∶200和1∶1000倍体积比拌土后，15d后辣椒种子萌发率分别为56.4％，52.2％和59.6％，而常规对照的萌发率仅为25％。以上结果表明，PTS-394菌剂的低浓度稀释液对辣椒种子萌发具有显著的促进效果。此外，辣椒温室盆栽植株促生结果显示，PTS-394菌剂1∶1000，1∶200和1∶100倍的稀释液灌根处理后，辣椒株高分别为20.7，22.4和21.2cm，而对照株高仅为17.5cm，相较于常规对照株高分别增加了18.3％，28.0％和21.1％，PTS-394粉剂不同稀释浓度处理均显著促进了辣椒的株高。综合比较PTS-394粉剂不同稀释浓度对辣椒种子萌发，株高的促生效果，兼顾成本、效果最佳原则，采用PTS-394粉剂按照稀释1000倍处理，其对辣椒的种子萌发和植株促生作用最为合适。

实施例4：枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂防治盆栽辣椒根腐病的效果评估

将PTS-394可湿性粉剂按照1∶100、1∶200和1∶1000倍稀释备用、辣椒根腐病菌于PDA固体培养基活化，28℃培养5d后，接入玉米粉和沙土配制(体积2∶1)的病土培养基中，28℃培养20d后，按照沙土培养基：过筛自然土，营养土和蛭石1∶1∶1∶1体积配比制作病土，准备进行防效等温室实验。温室盆栽防效试验：设4个处理，分别是接种辣椒根腐病菌病土处理(HALJ)、接种辣椒根腐病菌病土并灌根PTS-394粉剂1∶100倍液处理(HALJ+PTS-1∶100)，接种辣椒根腐病菌病土并灌根PTS-394粉剂1∶200倍液处理(HALJ+PTS-1∶200)和接种辣椒根腐病菌病土并灌根PTS-394粉剂1∶1000倍液处理(HALJ+PTS-1∶1000)。每处理30钵，重复3次。3个HALJ+PTS实验处理中，每棵辣椒苗灌根PTS-394粉剂稀释液20mL。移栽后第21d时，按照以下辣椒根腐病分级标准调查盆栽辣椒根腐病发病情况，并计算枯草芽孢杆菌PTS-394粉剂的防治效果。辣椒根腐病按发病严重程度分为5级，病级划分如下：0级，植株不萎蔫；1级，少量叶片表现可恢复性萎蔫；3级，叶片10％～30％萎蔫，叶仍绿色；5级，叶片30.1％～50％明显萎蔫，叶片发黄；7级，植株萎蔫，叶片50.1％～80％变黄萎蔫，根茎部变褐色；9级，全株枯死，根部腐烂。病情指数＝∑(病级株数×代表数值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)×100。防病效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

通过温室盆栽实验，初步评估了枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂不同稀释浓度对辣椒根腐病的防治效果，如表3所示，PTS-394可湿性粉剂100倍稀释浓度对辣椒根腐病的防治效果最好，防效达69.6％，随着使用浓度的降低，其防治效果也逐渐降低，当稀释1000倍时，其防效仅为22.6％。

表3 枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂对盆栽辣椒根腐病防治效果

实施例5：枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂防治田间辣椒根腐病的效果

试验时间：2016-2017年

试验地点：江苏省淮安市淮阴区渔沟镇杨庙村(春茬)和武敦镇王桥村七组(秋冬茬)设施辣椒大棚内进行；

试验品种：当地主栽品种：春茬为大富豪品种，秋冬茬为先红1号；

试验药剂：枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂；对照药剂为50％多菌灵，购自江苏辉丰农化股份有限公司。

育苗基质：播种育苗有机基质(淮安市中园园艺发展有限公司)。

试验方法：选取辣椒根腐病自然发病较重的1个温室大棚为试验大棚(春茬和秋冬茬，各1个大棚)，试验用苗按常规操作，经穴盘育苗和定植两个阶段。播种时将枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂和育苗基质按1∶100的体积比例进行混合，常规落种；定植时在定植沟中按照8g/棵(1∶100)或4g/棵(1∶200)的用量撒施枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂后，再移栽辣椒苗；浇800mL定植水，定植后隔15天，按照1∶100的比例用水稀释枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂进行灌根，每棵苗灌根400mL；在随后的浇水过程中，根据病害发生情况追施PTS-394粉剂1-2次，每个处理小区约360棵苗，重复3次，小区随机分布；对比药剂50％多菌灵按产品说明书推荐使用；同时设立清水对照组。

清水对照小区辣椒发病时调查发病情况，并计算防效；发病率＝调查小区发病株数/调查总株数×100；防效＝(处理小区的发病率-对照小区的发病率)/对照小区的发病率；试验结果如表4所示：

表4 枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂对田间设施辣椒根腐病防治效果

由表4可见，分别使用1∶100和1∶200倍稀释的枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂田间对辣椒根腐病防效分别为75.2-77.1％和68.5-70.4％，而化学药剂多菌灵的防效为55.7-63.3％，枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂田间防治辣椒根腐病的效果与常规化学药剂50％多菌灵的效果相当甚至略高。由此可见，合理、适时、科学使用枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂能有效防治田间设施辣椒根腐病的发生。

实施例6：枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂田间防治辣椒根腐病高效使用技术集成

经过以上实施例的筛选和评估，依据设施辣椒田间生产操作简易，低投入高产出的基本原则，集成总结枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂田间防治辣椒根腐病高效使用技术，具体要点如下：

步骤一，种子处理：选取饱满种子，在温水(40-55℃)中浸泡4-5h，随后将种子在PTS-394WP稀释液(1∶1000)中浸种过夜(12-16h)；

步骤二，育苗基质拌施：落种前，穴盘育苗的营养土用PTS-394WP拌土处理，按照10kg菌粉/m3土壤(1kg菌粉∶100L土壤)比例，均匀拌土并进行点播(兼具防苗期病害和促种子萌发作用)；

步骤三，定植处理：移栽前，枯PTS-394WP按照8g/棵苗均匀撒施定殖穴，移栽后浇活颗水，每棵苗浇水800mL，相当于将菌粉稀释100倍，用于防治根腐病；

步骤四：移栽后7d浇缓苗水，移栽15-20d后按菌粉1∶100倍稀释液灌根(400ml/棵苗)，并进行根部培土；

步骤五：依据不同种植茬口根腐病发生的时间，同步水肥规律，每间隔15-20d使用一次PTS-394WP(按菌粉1∶100倍稀释液灌根400ml/棵苗)，直至根腐病重要发生期结束(春茬：在辣椒定植(3月中旬)后，追施2次；秋冬茬：在辣椒定植(9月中旬)后追施2次；越冬茬：在辣椒定植(11月中旬)后追施1次，来年4月份开始再次追施2次)；

步骤六：在果实膨大期，可使用PTS-394WP(1∶1000)灌根，用于促进植株和果实生长；

步骤七：其他病虫害按常规模式管理。

目前，设施辣椒根腐病的防治主要还是采用化学药剂的防治方法，该方法容易造成对环境的污染和残留危害，随着生物防治理念的发展，利用生防微生物防控植物病害的技术得到了研究人员和经营农户的关注。本研究团队早期分离的一株具有较强抑菌作用的拮抗枯草芽孢杆菌PTS-394，该菌株可在植株根际定殖，能诱导植株产生抗病性，对茄果类青枯病、枯萎病具有较好防效。随着研究的深入，我们已经将其成功开发为生防菌剂(可湿性粉剂)，并已申请相关专利保护。

本发明首先通过平板对峙实验，初步明确了PTS-394菌株及其可湿性粉剂甲醇提取物对辣椒根腐病菌(茄柄镰刀菌)具有较好的抑制作用，进一步的质谱检测，发现可湿性粉剂中仍然含有脂肽类物质，但是脂肽类物质的种类及含量都有较多的损失。这表明从拮抗菌株的筛选到开发为成熟的制剂产品，会对生防菌本身的特性有较大改变，如何保持生防特性，也是生物防治研究领域的重要任务。温室辣椒盆栽的促生、防效等的评估实验显示，枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂使用浓度对辣椒的促生、防效有影响，呈现低剂量促生作用，而较高浓度为防治作用。以上结果，为枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂在田间辣椒栽培中的应用技术，提供了合适的使用浓度和使用时间等的筛选，通过集成田间高效使用技术并进一步进行示范和推广应用。本发明以生防制剂枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂为对象，不仅进一步拓展了其使用范围及防治目标，也为该产品的田间使用示范推广和进一步市场化提供理论基础。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

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