ELISA 基础知识总结

酶联免疫吸附测定（ELISA）的由来：酶联免疫吸附测定（ELISA）是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)上发展起来的免疫测定技术。1971年，瑞典学者Eugvall和Perlmann、荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别发表了用固相免疫测定方法检测体液中微量物质的文章，从此以后，酶联免疫吸附测定（ELISA）技术诞生并且发展十分迅速。

酶联免疫吸附测定（ELISA）的基本原理：以免疫学反应为基础，将抗体(或抗原)结合到固相载体表面,并保持免疫活性；使抗体(或抗原)与某种酶结合成酶标抗体(或抗原)，并且酶标抗体(或抗原)既保留免疫活性，又保留酶活性，抗原（或抗体）间接标记上酶，洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗原（或抗体）的量；加入酶反应底物后，底物被酶催化形成有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析。ELISA既可以对抗原进行测定也可以对抗体进行测定。

ELISA必不可少的三种试剂：

免疫吸附剂（吸附于固相载体的抗原或抗体）

标记物（酶标抗原或抗体）

显色剂（酶反应底物）

ELISA的基本流程：

包被或捕获：直接或间接（通过包被捕获的抗体）通过吸附将抗原或抗体固定到微量滴定板孔的内表面上。

封闭：添加无关蛋白质或分子以封闭微量滴定板孔内所有不饱和表面结合位点。

孵育：与固定抗原结合的抗原特异性抗体孵育。

检测：通过特异性抗体上结合的直接标记或二级标记检测产生的信号。

检测样品中抗原的操作流程（1、包被抗原2、加样品和一抗3、洗板4、加酶标二抗5、洗板6、加酶作用底物7、颜色的深浅与表抗原的量相关联）

ELISA的操作流程是不是很简单?可是看似很简单的事情往往会有各种各样的幺蛾子出现, 不过咱们有妙计在手, 完全不用担心和害怕, 请看表1。

表1 ELISA中可能遇到的问题及其解决方案

问题	可能原因	解决办法
低信号（样本和标准曲线）	1、旧涂层板或试剂   2、洗涤孔板过于剧烈 3、孔板内液体蒸发干了 4、反应不充分 5、波长不正确	1、准备新的板和试剂（检查pH值），适当储存 2、洗涤孔板时应轻柔 3、采用密封膜封板 4、优化反应温度和时间 5、检查酶标仪上的过滤器和软件
信号低（仅样本）	1、样品中待测抗原或抗体低于检测水平 2、样本类型不匹配	1、减少样品稀释倍数或浓缩样品   2、使用阳性对照确保匹配性
信号低/差（仅标准曲线）	1、标准品组合或存储不恰当 2、标准品添加错误 3、稀释计算不正确	1、重新配置标准品，储存在-70ºC 2、检查移液是否错误 3、检查计算
阴性对照有阳性结果	1、样品污染 2、洗涤不充分 3、检测抗体与包被抗体交叉反应（在夹心ELISA中）	1、小心使用新鲜试剂和移液器 2、增加洗涤次数 3、确保抗体不会发生交叉反应
高背景	1、空白孔污染 2、洗涤不充分	1、小心移液，使用多通道移液器 2、增加洗涤次数
高信号	1、样品中含有高于测定范围的抗原 2、洗涤不充分 3、样品颜色过深	1、稀释样品   2、增加洗涤次数 3、减少孵育时间或降低孵育温度
重复性不好	1、孔内有气泡 2、移液不一致 3、边缘效应（即与中心孔边缘不同的信号） 4、样品不均一 5、反应时孔板叠放	1、确保在加样后孔内没有气泡 2、使用校准的移液器并小心移液 3、确保所有的孔具有相同的温度和湿度，使用板密封膜并摇动 4、在移液前充分混合样品 5、不要叠放孔板板

ELISA的主要类型：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA。这四种ELISA各有优缺点（表2）

表2不同类型的酶联免疫吸附测定（ELISA）的优缺点

	优点	缺点
直接ELISA	1、快速、 2、避免了二抗交叉反应	1、灵敏度低 2、每种ELISA需特异性抗体；耗时且昂贵
间接ELISA	1、高灵敏度 2、节约成本 3、灵活；可以使用许多一抗	二抗之间存在交叉反应
夹心ELISA	1、极少需要纯化样品 2、灵敏度高且特异性强	1、必须使用“匹配”的一抗和二抗 2、耗时且昂贵
竞争ELISA	1、极少需要纯化样品 2、用于测量样品中的大范围抗原 3、用于小抗原 4、可变性低	特异性低，不能用于稀释样品

伴着ELISA的歌（ELISA的歌挺不错的 O(∩_∩)O哈哈~，推荐），写完了这些，咱们下期继续听着ELISA的歌，接着看看这四种类型ELISA之间的差别。

Reference

Stephanie D, Gan, Kruti R. Patel. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology (2013) 133, e12.