|
本人准备研究神经退形性疾病中的内质网应激反应，涉及ERAD，最关键的问题是不会检测泛素蛋白酶体功能，请问用什么指标检测，有什么范文？我找了一篇文章，他们用的好像是泛素抗体，分别检测高分子量和低分子量泛素蛋白的含量变化，但他们的方法我不太懂，希望高手帮助。 泛素和蛋白酶体功能有不同的测定方法： 泛素：没测过，文献好像一般用抗体。 26S蛋白酶体的测定：包括表达测定和蛋白酶体催化功能测定 其中，26S的亚型表达可用针对19S和20S亚单位的不同抗体，用western测，我用过CALBIOCHEM公司的，效果不错。 而26S蛋白酶体的三种酶催化功能（包括chymotrypsin-like activity, trypsin-like activity和PGPH activity）测定有相应的试剂盒，我用过CHEMICON的。或可以从sigma购买相应酶的底物肽（荧光素标记），原理都是测定释放的荧光强度，反应20S的酶活性。 祝实验顺利。 谢谢指教，我还不能确定内质网应激反应中是蛋白酶体的表达上调为主还是功能加强为主，可能是功能加强为主，上调内质网内的E2和E3，因此可能测泛素标记的分子比较重要。 可以从几个层面进行检测：泛素－蛋白酶体通路各因子的mRNA水平检测（RT-PCR和以标记cDNA为探针的Northern杂交），蛋白表达水平检测（Western bloting，用公司提供的抗体检测）和生化水平检测（检测chymotrypsin-like activity, trypsin-like activity和PGPH activity即CTL活性、TL活性和PGPH活性检测，用共用荧光底物检测粗提物的蛋白酶解活性），是不是还可以用HPLC检测呢？这样的话一般都可以发表一篇比较好的文章了。我正在准备做一个这样的试验，比你做的范围应该要更广，已经进入准备买试验所需各种试剂阶段，有机会一起探讨！ DIGE 兄请问一下那些相关试剂究竟贵到什么程度？望告知，我好造计划买，今年获得了一项市里3万元资助，估计还不够呢。 onbridger wrote 要是3万只买相关试剂倒是差不多够。 20S三种水解酶活性，对应的底物肽，一般都在1000-2000RMB（SIGMA价）/个。 如果需要纯化的proteasome，还可买相应的提纯试剂盒，要3000-4000RMB 对Western测定，就要看你选择哪些亚基了。相信楼上很清楚，19S和20S本身包括许多亚基组成，还有一些辅亚基。每个蛋白抗体均3000RMB左右。 谢谢 DIGE 兄啦，帮了我大忙了，另外还想问问蛋白酶体的抑制剂价格怎么样，听说满贵么？Leupeptin、calpain inhibitor I & II、MG115、MG132、PSI、PS-341、Lactacystin、Epoxomicin、eponemycin等的价格怎么样？可能您没有用到吧？你说的那些亚基我有知道，看了不少文献，我在一个帖子里面贴出来了，你也可以去看看。 > 估计一楼的可能是上海神经生物研究所的吧？ 回LS的，不是。是南医大的，无名小卒一个。 楼主做得怎么样啦，发贴谈哈子啦，也给大家参考参考研究思路，呵呵。 没做啊，计划被毖了。翻我的另一篇内质网应激的帖子就知道了。有篇文献里用了泛素的抗体，跑出的胶上有很多条带，大致分为高分子量泛素结合蛋白。中、低分子量泛素结合蛋白和游离泛素分子。通过与对照组的比较，若哪一块泛素结合蛋白含量增加，说明蛋白酶体功能受抑制。 可惜呀，你没做。我去年就和同事讨论说，下一年的国家自然科学基金中标项目里面一定会有几份是有关泛素－蛋白酶体系统 的，结果后来一搜索，真的如此。热点，新点！ 个人觉得，UPS（ubiquitin-proteasome system）虽然是热点、新点，但并不是理想的靶点。该系统参与了太多蛋白的降解过程，具有普遍性，而无特异性。研究起来有难度，开发成治疗或调控靶点，更是难上加难。 我觉得只要是“通路”一类的玩意，都未免繁复，这也是医学最让人类头疼的地方，我想很多医学问题还没有答案，也与这些关键性的问题都还没有弄清楚有关，真的等把这些“主干道”弄明白了之后，应用也就为时不远了。何况，也不是说一定非得让这条通路本身的某个节点成为靶标方有意义呀，其实只需它能帮我们把问题的实质弄清楚，治疗或者调控也就不止一条途径了。 其实泛素蛋白酶体系统应该是很好的靶标，泛素化本身就是特异性蛋白降解途径，很多疾病过程中涉及蛋白酶体功能抑制。我们关键是没有很好的促蛋白酶体功能的药物，而比较多的研究是泛素蛋白酶体抑制剂的毒性作用。就拿内质网应激这个早期过程来说，减轻蛋白质负荷绝对是保护性的，因此我们要增强蛋白酶体功能，不会因为增强了其功能就会导致正常蛋白的降解，除非E3联结酶出问题。 |
|
|
