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转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位定性、定位或定量研究的实验技术。 IHC定量研究中免疫组化图片该如何分析？今天就使用ImageJ软件给大家分享免疫组化图片分析方法。ImageJ软件是美国NIH开发的一款在生物医学中应用十分广泛的免费软件，下载地址为https://imagej./ij/ 。 该软件的显著优势是开源、免费，不受电脑系统（官网提供适用不同操作系统的版本）的限制且功能强大。 先前分享的10步填上免疫组织化学（IHC）的坑的文章中介绍了使用IHC Profiler插件对免疫组化结果进行打分，有兴趣可以点这里。今天给大家分享另一种免疫组化图片分析方法，分享之前先介绍两个概念： 1 什么是灰度值（Gray value）？ 灰就是不够黑，介于黑白之间。用于显示的灰度图像通常用每个采样像素8 bit的非线性尺度来保存，这样可以有256种灰度（8bits即2^8=256）。 使用直线工具 在ImageJ菜单下Analyze，Plot Profile（快捷键Ctrl+K）可以找到Plot Profile工具，可得到从纯黑变化纯白的灰度变化： 纯黑灰度值为0，纯白灰度值为255，0-255之间即为灰。 免疫组化图片无组织背景为白色，理论上说灰度值应为255。以一张小鼠肺免疫组化染色为例，将鼠标放于下图十字处可在红框处得到图片的RGB值分别为255,254,255，说明其图片拍摄条件合理。正确的组化图片拍摄无组织处背景应为白色。 如何正确进行免疫组化图片的拍摄？ 显微镜光源 正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色滤光片，灯丝电压为10V左右。一般的显微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。 不能通过调整光圈的方法减低亮度，这会影响到图象的清晰度。光圈与聚光镜要按照柯勒方法调整以保证照片的清晰。 不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的灰度滤光片还行。6%的灰度滤光片会导致色彩失真。 如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从而使得测量结果不准确。 固定显微镜的工作条件 不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上拍摄照片。 为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光源亮度的稳定。 应该使用手动控制曝光的相机 对每张照片要使用相同的曝光时间，而不是由相机自动控制曝光。 染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。 控制相机曝光时间 要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。 拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。 把空白灰度值调到230相当于在分光光度计上调节100%透射。 避免使用相机的自动白平衡 自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片进行各自不同的白平衡校正。这会严重影响分析测量的准确性。显微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩就应该是不平衡的，不能校正。由于免疫组化照片上黄色染色多,自动白平衡会将图片色调向蓝色调整,导致色彩的失真。 应当把照片存为无损压缩格式TIFF 保存为jpeg格式后会损失亮度细节，导致测量误差增大。要注意相机上直接保存为jpeg的图片就没必要转成TIFF了。 总结 调整显微镜光源亮度，足够白，足够亮。 调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值最好能达到230以上。 确认相机未使用自动白平衡功能。但可以使用手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。 使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件一次拍摄完所有照片。 保存照片为TIFF格式。 2 什么是光密度值（Optical density）？ 光密度值即通常所说的OD值， OD值符合朗伯-比尔定律，其数学表达式为： 光密度值是直接与染色物质量相关，被测物质的量越多，OD值越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。OD值与灰度值是什么关系？ 其对应关系如下图： 灰度值为255，纯白处OD值为0，即光100%投射没有任何物质。理论上OD值是从0无穷大。因为值随光源强度改变而改变，是发射幅度和入射幅度功率比值的一部分，际应用中，OD值的范围常用0-2.71。 ImageJ软件中OD值与灰度值如何转换？ 首先将图片转换为灰度图片，Image，Type将图片改为8-bit。 其次在进行转换，Analyze，Calibrate，选择Uncalibrate OD即可校准。
此时灰度值255变成了OD值0，灰度值0变成了OD值2.71:
再次以小鼠肺免疫组化染色为例，将鼠标放于下图十字处可在红框处得到图片的OD值为0，括号内为对应灰度值为255，OD值为0说明空白背景处没有任何阳性物质.此外灰度为0（纯黑处）OD值为2.71：
OD值与灰度值分别应该在何种情况下使用，文献中经常会出现的Intensity（a.u.）= Intensity arbitrayr unit，即任意单位。免疫组化图片分析应该以灰度还是OD值来分析呢？
以灰度来统计的话，无组织背景纯白255左右，DAB着色越深灰度值反而越小，这与我们的认知不符。因此，免疫组化图片分析应该以OD值分析，背景纯白OD值接近0，DAB着色越深OD值越大，物质的量越多。 免疫组化图片在对于比较不同组间物质的量的多少可能会出现以下三种情况： 1、 DAB着色一样深，表达面积大的含量多（A<B）：
2、 DAB表达面积一样大，着色深的含量多（A<B）：
3、 前两种情况实际情况中不常见。一般情况下，着色深的表达范围小，表达范围大的着色浅，该如何比较？
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。此值与目标物质的总量成正比。IOD值除以目标分布区域的面积，得到Average Density（Average Optical Density，AOD） ，此值反映了目标物质的单位面积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时，就是比较它们之间的平均光密度值的大小。
计算AOD需要计算积分光密度值IOD与阳性面积。在ImageJ软件Analyze下选择Set Measurements设置测量参数，选择Integrated density，Area，Limit to threshold（Image -> Adjust -> Threshold 调节阈值，红色代表选中，选择Limit to threshold只计算红色选择的面积），点击OK。
步骤即为： 1、 打开图片，Image，type，8-bit将图片转换为灰度图片。 将8-bit灰度图片转换为OD值：Analyze，Calibrate，选择Uncalibrate OD即可校准。
2、 选择需要测量的参数：在ImageJ软件Analyze下选择Set Measurements设置测量参数，选择Integrated density，Area，Limit to threshold（Image -> Adjust -> Threshold 调节阈值，红色代表选中，选择Limit to threshold只计算红色选择的面积），点击OK。 Image -> Adjust -> Threshold 调节阈值，选择所有阳性信号（红色代表选中）：
Analyze，Measure（快捷键Ctrl+M），得到结果：
即该图片的平均光密度值为0.46。 总结 免疫组化图片分析正确首先需要正确的拍摄图片，其次搞清楚灰度值、光密度值等基本概念再使用软件进行免疫组化的定量计算即可。 免疫组化图片分析方法今天就给大家分享到这里，希望对家有所帮助。 |
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