CRISPR系列之二：看魔剪如何征服DNA（共七期）

长生果与无花果 2018-11-26

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首先，来看看曾经轰动一时的案例：中山大学研究人员利用CRISPR-Cas9校正人胚胎中的突变。中国科学家利用CRISPR/Cas9对人胚胎中会导致地中海贫血的β珠蛋白基因突变成功地进行修饰，目的是希望利用CRISPR对这种基因突变进行校正，以便实现利用基因疗法治疗地中海贫血。文章发表在《蛋白·细胞》（Protein & Cell）杂志上^[1]。

黄军就（首次在人胚胎细胞使用CRISPR技术）

β-地中海贫血是一种潜在地危及生命的血液疾病，它在全世界的患病率大约是十万分之一。研究人员利用来自一名β-地中海贫血患者的组织构建出克隆胚胎，随后对这些胚胎中的DNA进行了测序，发现一种单核苷酸错误，即应当为A的碱基被替换为了G。接下来他们研究利用CRISPR将这种碱基转换回去，即实现G到A。这也是首次证实利用CRISPR系统治愈人类胚胎中的遗传疾病是可行的。但这项研究造成巨大影响力的原因还有：它是在婴儿胚胎里面开展的，虽然医生丢弃的是不会成功孕育出婴儿的异常胚胎，但这点还是受到了部分学者的批评和攻击。

就在这不久之后，《新英格兰医学杂志》（NEJM）报道了巴塞尔大学研究人员利用CRISPR找到导致红细胞增多症的第一个遗传突变。^[2]。

通过使用全基因组连锁分析和基因测序，研究人员发现所有受影响的家族成员的EPO基因中都缺少一个单碱基。而EPO的增加正是导致血红细胞过多产生的原因。但困惑的是，这个碱基的缺失导致了基因编码读码框架发生移动，最终导致EPO基因功能缺失而不是增强。但实际情况是，病人血液中EPO的含量是增加而不是降低。最终，还是CRISPR帮研究人员找到了答案。原来，EPO基因中还有一个隐藏的mRNA，正常情况下并不参与形成EPO。基因突变导致这个基因的读码框架发生移动，从而导致了这个基因产生了更多的EPO。

除了在血液方面的应用，CRISPR在发育方面也卓有建树。近期《自然》（Nature）就报道了英国和韩国的研究人员利用CRISPR/Cas9揭示OCT4基因在人胚胎早期发育中发挥着关键作用。在正常情形下，OCT4基因在人胚胎的最初几天发育中是有活性的，它驱动受精卵分裂，大约7天后形成一种有大约200个细胞组成的球体，即囊胚。在实验中，他们用CRISPR/Cas9阻断人胚胎OCT4的表达后，这些胚胎的发育都停止了^[3]。

CRISPR另外一个价值就是能够用来追踪细胞，这个功能在癌症方面都有着重要的作用。斯坦福大学的研究人员就将CRISPR基因编辑技术同DNA条形码技术结合，有效追踪癌症进展。

人类的癌症并不仅仅只有一种肿瘤抑制突变，其存在多种突变组合。为了了解不同的突变基因是如何相互作用的，研究人员们耗费了数年的努力来绘制图谱，包括构建多种不同谱系的遗传修饰化小鼠，其中每一种都携带不同的失活肿瘤抑制基因。而如果想探索所有的可能性组合，研究人员就需要上千只小鼠。

CRISPR-Cas9的强大之处在于，可以轻易地替换、修改或删除生物体内的基因序列，从而在单个小鼠的肺中创造出多种基因不同的肿瘤。问题在于，为了得出关于不同基因突变组合效应的有用结论，科学家需要一种精确的方法来标记追踪不同肿瘤的生长。但如果将CRISPR-Cas9和DNA条形码技术（利用生物体DNA中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的技术）相结合以此来追踪癌症的生长发展情况，就能帮助科学家们在实验室中复制出癌症患者机体中所观察到的遗传多样性。就比如将短的、独特的DNA序列（DNA条形码）黏附于小鼠肺内的单个肿瘤细胞中，这样每一个序列的功能就像是遗传条码，当每个癌细胞扩增时，条码的数量会随之增加。最后只需要将整个癌肺取出，然后用高通量的DNA测序和计算来分析条形码出现的频率，从而精确的确定肿瘤的大小。

也就是说，研究人员可以在同一个小鼠身上产生大量具有特定遗传特征的肿瘤，并在规模和精度上分别跟踪它们的生长。研究人员最终只在几个月之内就完成了相关实验，只用了不到24只小鼠。结果发表在《自然·遗传学》（Nature Genetics）上^[4]。

无独有偶，Nature重量级子刊《自然·生物科技》（Nature Biotechnology）也报道了德国研究人员利用CRISPR/Cas9诱导的DNA瘢痕序列追踪细胞谱系^[5]。

在生物界一直有一个问题困着大家，功能不同的细胞系到底来自于何处？而CRISPR有一个特点是总在确切的位点上进行切割，受此启发，德国科学家团队开发出一种被称作LINNAEUS（lineage tracing by nuclease-activated editing of ubiquitoussequence, 通过对普遍存在的序列进行核酸酶激活的编辑来开展谱系追踪）的技术，它能够让人们确定细胞类型和每个细胞的谱系。

在斑马鱼胚胎细胞中如何切割DNA，在下一次细胞分裂发生之前，给DNA修复时间不超过15分钟。修复工作必须快速完成，这也是错误累积的地方，这种错误序列我们就称之为DNA瘢痕序列。DNA中的瘢痕序列具有随机的长度，而且它们的确切位置也会发生变化。子细胞在细胞分裂过程中遗传这些瘢痕序列。当这些瘢痕序列汇总在一起时就像条形码一样发挥作用，能够确定每个细胞的谱系。

因此研究人员设计了一个实验，在斑马鱼的胚胎内注入CRISPR-Cas9系统，这些斑马鱼事先被转入了红色荧光蛋白（RFP）。在接下来的时间内，Cas9重复性地切割斑马鱼体内的RFP。这些斑马鱼胚胎中的红色荧光逐渐消失的同时，数千个瘢痕序列在细胞中DNA损伤区域中形成。最终通过分析瘢痕序列，就能确定细胞是来自于哪个祖细胞。