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信使RNA翻译成前体蛋白之后，还可以进行各种各样的修饰，增加其功能的多样性。 我们以组蛋白H3为例，来说明不同的修饰类型和修饰位点可以发挥不同的功能。H3K4me3修饰发挥的是转录激活的作用，而H3K27me3发挥的却是转录抑制的作用。 一篇好的蛋白翻译后修饰的文章可以发表在CNS的主刊也并不为奇，CNS的子刊里蛋白翻译后修饰的文章更是遍地开花。但要达到一定的高度，并不是一两句话可以说清楚道明白的。所以我们今天只讲初级策略。
以这篇发表在NATURE COMMUNICATIONS (IF=12) 上的文章：CaMKII-mediated Beclin 1 phosphorylation regulates autophagy that promotes degradation of Id and neuroblastoma cell differentiation 来说明。 第一步：首先要确定你要研究的蛋白。 功能上越重要的蛋白研究的意义就越大，但是功能上非常重要的那些蛋白，研究得已经非常多了，所以你得确定你想要研究的东西，目前还没有被研究。这篇文章要研究的是Beclin 1蛋白的磷酸化。
Question 1: Beclin 1蛋白被哪个激酶磷酸化？  寻找激酶，我们有这么几种方法。 1、利用Scansite进行蛋白质磷酸化预测，网址：https://scansite4./4.0/#home 2、Human Protein Reference Database，网址http://www./ 3、在CST官网的最上方有一个工具，叫phosphosite，这个也可以预测磷酸化位点； 4、有一些磷酸化预测的小工具，如GPS (Group-based Prediction System v3.0)等。 经历过大概这几种方法找到这个可能的激酶后，如果能验证一下这个激酶刚好与我的底物蛋白有结合，那么此激酶可以磷酸化该底物蛋白的可能性就非常大了。
Question 2: 怎么预测这个激酶和我的底物蛋白结合方式？ 1、STRING数据库，这是比较经典的蛋白互作数据库，数据库使用非常简单。 网址：https:///
2、inBio Map数据库，可以在线使用也可以离线安装使用，根据个人的喜好。 网址：https://www./inbio/map.html#search 完成了以上几步之后FIG 1A的图就可以做出来，这时候大家都喜欢给这段发生磷酸化的片段做个序列保守型分析，也就是Fig1b。
第二步：实验验证磷酸化 有了以上的数据分析，我们的心里大概是有点底了，这时候就要进行实验验证了。
1、在细胞内验证磷酸化的存在； 2、体外激酶实验确定磷酸化的存在； 3、体外激酶后，用磷酸化质谱确认磷酸化位点； 4、定制该磷酸化位点的抗体，用该抗体检测其在细胞中根据处理条件的变化而变化的磷酸化水平。 5、敲低或者过表达激酶，或者使用该激酶的抑制剂，观察底物磷酸化的情况，进一步说明激酶跟底物之间的磷酸化关系。 第三步：验证相互作用关系——是否有结合 1、经典的验证结合的实验：CO-IP, 免疫荧光共定位 2、进行质粒分段，明确具体的结合区域。 第四步：激酶跟底物蛋白发生相互作用后，也就是磷酸化后有什么功能。 这是重头戏，功能的强大与否就决定了你文章的水平了。这些功能一般是：促进肿瘤生长，增殖，转移；或者是诱导底物蛋白的出核入核；又或者是影响底物蛋白的稳定性等等。
在这篇文章里，Beclin 1 在自噬的过程中是发挥了很重要的作用的，所以最后研究的重点转移到了自噬上去。跟自噬密切相关的蛋白翻译后修饰是泛素化。泛素分子的分子量较磷酸分子的分子量要大得多，有7KD，并且多是链状，所以泛素化的图是这样的——条带涂布状。 顺便给大家介绍几种泛素化预测的方法：
 1、UBPred数据库，网址：http://www./ 2、NetChop数据库， 网址：http://www.cbs./services/NetChop/ 泛素化的E3酶的预测就没有磷酸化激酶预测那么直接了，一般需要用筛选的方法来进行，常见的E3酶不算多，建立一个小型的E3酶siRNA库，就可以找到自己需要的E3酶了。
泛素化的研究常常需要鉴定泛素化的类型，泛素化一共有7个不同位点的修饰，K6 K11 K27 K29 K33 K48 K63,建立这些不同位点突变的泛素分子的质粒，与底物蛋白共转之后，可以根据泛素水平的变化判断修饰类型，最常见的是K48和K63型。
第五步：动物实验和（或）免疫组化之类 为了进一步升华我们的文章，我们需要在动物身上或者是病人标本身上验证我们所研究的东西。这时候就要根据我们第四步得到的功能来进行实验设计了。
注意：这些实验往往需要在不同的细胞株中进行验证，全篇只在一个细胞株中做是不够的。稳定株中的实验更能说明问题，瞬转实验说明机制的同时，要好好利用稳转株做实验的优势。
简单的套路已经给大家介绍完了，还是有很多细节的问题是值得去考虑的，关于升华就要靠大家自己去体会了。嗯，做完这个简单的套路，大概就有12分了。 |
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