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之前我们提到过，对于发生修饰和未发生修饰的蛋白，它们之间主要的差异其实是官能基团的区别，通过质谱的方法，可以帮助我们对修饰位点、修饰肽段进行定性定量的研究，从而深入到机制研究。那么今天我们就来详细介绍一下，蛋白修饰组学到底是怎么研究的。 图1.蛋白修饰组学实验流程 第一步：修饰肽段的富集 通常发生修饰的蛋白含量都比较低，用常规的提取方法无法获得足够后续分析的修饰蛋白，因此需要先对样本中的修饰蛋白进行富集。 以磷酸化蛋白为例，它的富集方法非常多，有金属氧化物亲和色谱法（TiO2 /Al2O3…）、固相金属亲和色谱法（IMAC）、预分离色谱法、化学衍生修饰法、免疫亲和富集法等等。但目前最主流的富集方法就是TiO2富集法，TiO2在酸性溶液中带正电荷，可以与磷酸化肽段产生静电作用，从而使磷酸化的肽段得到富集。 不同的修饰模式的富集策略也有所不同，比如糖蛋白通常采用凝集素亲和的方法进行富集，而乙酰化主要抗体的进行富集等等。不管是哪种修饰类型，总之，第一步就是要把修饰的肽段进行富集，当我们富集到足够的修饰肽段之后，就可以拿去打质谱啦。 第二步：质谱分析 刚刚我们说过，修饰与未发生修饰的蛋白主要的区别在于官能基团的存在与否，对应的也会改变蛋白的分子量，而质谱可以帮助我们识别出这些发生分子量变化的蛋白。我们在鉴定的时候，会先通过一级质谱对肽段判断，通过分子量有没有增加或减少来判断是否发生修饰。 当一级质谱确定有无修饰后，再通过二级质谱进一步判断是在哪个氨基酸上增加了分子量，从而获得修饰位点的信息。获得了这些信息之后，我们就可以对这些肽段进行生信分析。
第三步：生信分析 生信分析其实是和我们文章最相关的部分了，因为前期的步骤都是放在method部分介绍，而这一部分是要需要花心思进行详细解读的，那么我们一起来看下通过生信分析可以获得什么样的信息吧。 1 质控信息 当我们看到检测结果的时候，是不知道效果好不好，因此需要对结果进行质控。通常质控主要看质谱图数是否理想、谱图质量是否合格、质谱精度是否稳定等等，以证明实验做的不错，可以放心的进行后续分析。通常这一部分的结果可以放进毕业论文或者文章的附图中，不用在正文中过多介绍。 图2.质谱检测质量精度分布图
2 总体情况展示 当我们知道质谱结果没有问题之后，就可以对结果开始分析了。分析的第一步，就是要对总体修饰情况进行统计，即发现了多少个修饰蛋白，多少个修饰肽段，以及多少个修饰位点。 另外由于磷酸化会发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸上，我们还可以统计发生在这3种氨基酸上的磷酸化数量，不过由于它们的比例已经被研究的非常透彻（1800:200:1），通常不会有太大的差别。通过对这些修饰信息的统计，可以帮助我们了解样本的修饰情况，也为后一步的差异分析打下基础。 除了修饰情况，我们还可以用PCA或PLS-DA图展示样本的情况，方便我们判断样本的重复性和组间的差异程度（和常规的转录组、蛋白组差别不大），通常放在文章中展示样本的重复性比较好，实验没什么问题，并且组间具有差异，可以往下进行分析。
图3.磷酸化位点和磷酸化蛋白的数量（左）和PCA图（右）
3 差异蛋白情况 整体分析完之后，接着就是进行差异的修饰蛋白分析，差异分析可以说是文章非常重要的一环，通过对蛋白进行差异分析，我们可以得到不同比较组之间的差异情况，而这些差异的蛋白，可能就是导致不同样本之间表型差异的主要原因。在这一部分我们通常可以利用火山图或热图展示这些差异蛋白。 由于这些蛋白可能与表型差异息息相关，因此，我们常常会针对这些蛋白进行GO和KO富集分析，从而了解这些差异蛋白所富集的功能，帮助我们找出与表型差异有关的通路，推测出可能存在的调控机制。这部分的分析同样和常规的转录组、蛋白组差别不大，针对富集结果，挑选出与目标相关的通路、蛋白深入讨论就可以了。 图4.聚类热图（左）富集分析气泡图（右）
4 个性化分析 除了上诉的分析，在蛋白修饰中，还有一个非常重要的分析点——motif分析。蛋白质的序列 motif在蛋白中普遍存在，可以被用于蛋白质功能的预测工具。而蛋白修饰过程中通常需要相应的酶识别特定的motif，所以对修饰蛋白的motif进行研究，可以帮助我们了解修饰蛋白可能参与的具体生物学功能。 此外，我们还可以对修饰蛋白进行互作蛋白的string分析，通过蛋白质网络图了解修饰蛋白可能存在相互作用的蛋白，从而更深入的了解这些修饰蛋白的功能。另外，蛋白所处的位置不同，功能也会不一样，因此有些文章会对这些修饰蛋白进行亚细胞定位（比如用WoLF PSORT预测），推测修饰蛋白所处的位置。 在多结构域蛋白质中，不同的结构域常常与不同的功能相联系，因此也可以用InterProScan预测蛋白的结构域。针对蛋白的个性化分析有各种各样，我们也可以根据不同的需求进行不同的分析。
Motif分析结果
String分析结果
其实，现在的蛋白修饰文章套路和早期的转录组文章类似，将测序获得的结果进行分析和总结，获得一定的结论，就可以进行文章发表了。 |
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