WGBS 建库关键技术之扩增

WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequencing），即全基因组亚硫酸氢盐测序，它既可以覆盖所有甲基化位点，能够绘制单碱基分辨率的全基因组甲基化图谱，还能够配合靶向技术检测低频甲基化信号，但是传统 WGBS 数据存在一个严重的问题， BS 处理后，未甲基化的 C 会转化为 U，而甲基化状态的 C 则保持不变；该过程会导致基因组序列组成发生天翻地覆的改变。

外一个不容忽视的问题是：DNA 聚合酶对于含 U 的模板扩增效率大大下降，扩增的偏好性大大增加。如果能决定这两个问题的话，那 WGBS 将会得到更广泛的应用，特别是对于 ctDNA 的甲基化测序。

为此，KAPA Biosystems（现为 Roche KAPA)利用“分子进化”技术开发的 Kapa HiFi Uracil+ DNA 聚合酶。该酶能高度耐受模板链中的 U，同时保持了高扩增效率和保真性，这使其能够高准确度、有效地扩增亚硫酸盐处理后的 DNA。

高效扩增含尿嘧啶的模板

来源于 KAPA HiFi DNA 聚合酶的尿嘧啶耐受的，具有校正功能的扩增酶

KAPA HiFi Uracil+ReadyMix 不受 dUTP 抑制。

SYBR® Green 法实时荧光定量 PCR 检测 dUTP 对 PCR 扩增的影响，结果显示 dUTP 可以抑制常规 PCR 反应液的扩增 (左)，而 KAPA HiFi Uracil+ ReadyMix (右) 无扩增抑制 (dUTP 浓度为 0.2 mM，扩增片段长度为 452 bp，模板稀释比例为 80 pM-0.8 fM)。

解锁亚硫酸氢盐转化文库构建的真正潜能

• 通过更高的文库产量和更少的扩增循环数来降低 PCR 重复和偏差

• 高扩增效率保证长片段文库构建质量

KAPA HiFi Uracil+ ReadyMix 提供更高的文库产量和最小的文库分子大小偏差。

使用 12、14 或 16 个循环的标准方案扩增人类全基因组亚硫酸氢盐处理的文库，并使用 Bioanalyzer® 2100 高灵敏度 DNA 检测系统分析扩增文库。与 A 相比，KAPA HiFi Uracil+ ReadyMix 的产量更高 (左)，片段大小偏差更小 (右)。

与 DNA 甲基化测序应用无缝连接

• 高效扩增亚硫酸氢盐转化的文库

• 改善亚硫酸氢盐测序 read 的质量

KAPA HiFi Uracil+ReadyMix 成功扩增简化亚硫酸氢盐测序文库。

起始量为 500 ng 或 10 ng 的小鼠 B 细胞基因组 DNA，经 MspI 消化后，使用 KAPA HyperPrep Kit 构建文库，及使用 KAPA HiFi Uracil+ ReadyMix 进行最后文库扩增。500 ng 文库扩增 10 个循环，10 ng 文库扩增 15 个循环。(A) 10 ng 文库与 500 ng 文库 (左) 以及两次 500 文库之间 (右) 有着很好的相关性。(B)碱基组成与序列位置关系图显示，测序结果中 >95% 的 reads 都是以 MspI 切割位点 (CCGG) 开头。数据来自 Emory University (Atlanta, GA, USA)。

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