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多重PCR技术要点全解析(含详细优化方案)

2018-12-08  生物_医药...

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多重PCR概述
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多重PCR(multiplex Polymerase Chain ReactionmPCR)也称复合PCR,由Chambehian'1988年首次提出其基本原理与常规PCR相同,区别在于多重PCR反应体系加入一对以上引物,各对引物分别结合在模板相对应部位,最终扩增出一条以上目的DNA片段(图1)。

 

图1. 多重PCR原理

多重PCR可以通过优化反应体系和反应条件提高扩增的片段数量。理论上只要PCR扩增的条件合适,引物对的数量可以不限。另外,多重PCR在引物和反应条件的设计方面表现出很大的灵活性,既有单个PCR的特异性和敏感性,又较之快捷和经济,自提出以来已被广泛应用于包括核酸诊断在内的诸多领域(图2)。

图2 . 多重PCR的应用


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多重PCR之难
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需要指出的是多重PCR实验并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系。多重PCR之所以难,在于多个靶点之间扩增条件不兼容,每个靶点都需要旁边其他的引物配合。举个例子,就像“绑腿赛跑”(图3)。

 

图3. 绑腿赛跑

每个靶点的成功扩增都需要被捆绑在一起的两个人(一对引物)配合默契。而多重PCR就需要多对选手同时起跑又同时到达,并且所有参赛的每对选手都有最好的,而且均衡的发挥。


因此,多重PCR实际操作过程中的扩增效果和实际扩增的片段数目往往不尽如人意。而为了达到更好的扩增效果,一般我们可以通过以下几个方面进行优化:


2.1 引物

多重PCR实验中要求加入的多对引物既不能互相结合,也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。另外传统的多重PCR实验中,为了使结果便于凝胶检测,还需设计不同扩增子片段大小不一。更麻烦的是,多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源,其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到,而低丰度的模板彻底沦为背景。因而引物设计除了遵循一般的规则之外,还需要注意以下几点:


a. 引物特异性:

各引物与其它扩增片段不能存在较大的互补性,扩增片段之间也不能有较大同源性;

b. 引物长度:

一般18-24碱基,各引物之间不能互补,尤其避免3’端互补。较长的引物更易形成二聚体;

c. 退火温度:

退火温度选择标准:提高每一对引物的退火温度,然后在mPCR的时候采取最低退火温度;

d. 引物结构设计:

通过一些独特的结构设计,避免非特异性扩增或者引物二聚体。比如Ω引物(如图3),该引物包括三部分,5’端的序列,Ω环,3’端序列。其中两端的序列是和目标区域互补的,而环不是。对于Ω引物,当5端和3端序列完全配对才可以进行目标区段扩增,否则其结构不稳定(因为Ω环存在),导致扩增失败。

 

图4:Ω源联川生物图

常用引物设计网址:

(only for cancer researchers)


2.2 反应体系

多重PCR的反应体系也是影响扩增效果的重要因素之一,体系中的各组分需满足每对引物对应的靶点的扩增量的要求。反应体系包括引物、模板、缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等,其作用与优化方法如下表1所示。

表1. 反应体系的优化

注:本文中DNA聚合酶以Taq DNA聚合酶为例。具体实验中,还可以在反应体系中适当增加浓度为5%的DMSO或者5% 的甘油等辅助剂,有利于提高扩增效率以及特异性。


2.3 反应条件

多重PCR反应中会存在以下两种问题:1)目的产物长度不尽相同,而较小片段总是优先得到扩增;2)各对引物的最佳PCR条件也不尽相同,比如较长片段需要更长的延伸时间。因此为了保证最终扩增产物的量尽可能的一致,在优化反应条件的时候,尽可能选择有利于较大片段扩增的条件,见表2。

表2. 反应条件的优化


3. 常见问题解决办法

多重PCR扩增的时候最主要的问题:二聚体、非特异性扩增以及扩增产物条带较弱。

表3. 常见问题解决办法


多重PCR要求在同一反应体系内对多个位点进行特异性扩增。因而引物间的配对与竞争性扩增均会影响扩增效果。如果能选择合适的反应体系以及反应条件则有望提高多重PCR的扩增效果。所以在进行多重PCR的时候,不应墨守陈规,要根据自身实验情况对实验条件进行不断优化,达到最佳扩增效果。


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